カトマンズ渓谷の野良犬からの犬ジステンパーウイルスの系統学的特徴付け

Virology Journal volume 20、記事番号: 117 (2023) この記事を引用

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

犬ジステンパーは、飼い犬や野生の肉食動物の犬ジステンパーウイルス（CDV）によって引き起こされる非常に伝染性の高い、多くの場合致死的な病気です。このウイルスは、野生および保護価値の高いトラ、ライオン、ヒョウなどの肉食動物の両方で大規模な流行を引き起こした。したがって、トラ、ヒョウ、ユキヒョウ、ドール、オオカミなどの多くの種の絶滅の危機に瀕している野生の肉食動物が生息し、野良犬の人口も多いネパールでは、CDV の発生を理解し、管理することが特に重要です。これまでの研究では、CDVが野生の肉食動物に脅威をもたらす可能性があることが示唆されているが、ネパールの肉食動物で流行しているウイルスの遺伝子株を特徴づける研究はなかった。私たちはカトマンズ渓谷の野良犬から侵襲性および非侵襲性の生物学的サンプルを収集し、系統解析を使用して犬の CDV 株がアジア 5 系統に属することを遺伝的に特徴付けました。同じ系統には、インドのイヌ、ジャコウネコ、レッサーパンダ、ライオンから配列決定された CDV 株も含まれていました。私たちの系統解析に基づいて、CDVは同所性肉食動物の間でシルベートサイクルを通じて維持され、反復的な波及と発生を可能にしている可能性が高いと考えられます。保有宿主から他の種、特にネパールの絶滅危惧種の大型肉食動物へのウイルス感染を防ぐことが極めて重要です。したがって、飼い犬に加えて野生の肉食動物を対象とした CDV の定期的な監視を推奨します。

犬ジステンパーは、犬ジステンパーウイルス（CDV）によって引き起こされる非常に伝染性の高い、多くの場合致死的な病気です。 CDV は、パラミクソウイルス科のモルビリウイルス属に属する一本鎖エンベロープ RNA ウイルスです [1]。この病気はエアロゾルによって伝播し、感染した飼い犬 (Canis lupus Familyis) や野生の肉食動物に特徴的な呼吸器症状、胃腸症状、神経症状を引き起こします [1、2、3]。 CDV はイヌの病気であると考えられがちですが、食肉目のほぼすべてのメンバー、および一部の霊長類や有蹄動物でも CDV が報告されています。重要なことは、CDV は保護価値の高い野生の肉食動物に大規模な流行を引き起こすことが知られているということです。たとえば、CDV の発生により、セレンゲティ国立公園のアフリカライオン (Panthera leo leo) とギル国立公園のアジアライオン (Panthera leo persica) の大量死が引き起こされています [4,5,6]。同様に、ロシア東部で死亡したアムールトラ (Panthera tigris altaica) とアムールヒョウ (Panthera pardus orientalis) から CDV が分離されています [7、8]。この病気は、米国の動物園で飼育されているトラやヒョウ、さらに米国やヨーロッパのミンク、フェレット、テンなどの飼育動物にも感染することが判明しています[9、10]。近年、これらの発生は、CDV の新興系統がこの病気の宿主範囲を拡大していることを示しています [11]。

CDV の流行を理解し、管理することは、トラ、ヒョウ、ユキヒョウ (Panthera uncia)、ドール (Cuon alpinus)、オオカミ (Canis lupus chanco) など、多くの種の絶滅の危機に瀕している野生の肉食動物が生息するネパールで特に重要です。大量の野良犬[12]。さらに、ネパールの野生ネコ科動物に関する最近の血清監視研究では、トラとヒョウのCDV曝露が確認され、検査された大型ネコ科動物の3分の1以上が症状を示し、3頭がサンプリング後すぐに死亡した[13]。同様に、以前の研究では、CDV がネパール全土の野良犬集団に蔓延していることが示されています。 2017年と2019年に実施されたチトワン国立公園とその緩衝地帯周辺の野良犬の個体数に関する2つの独立した調査では、CDV抗体の血清保有率がそれぞれ17%と80%であることが特定された[14、15]。 2018年にマナンで行われた同様の研究では、犬の70％でCDV抗体が確認され、RT-PCRスクリーニングでは13％が陽性反応を示した[16]。どのような状況においても、イヌや野生の肉食動物はCDVのワクチン接種を受けていなかったので、CDV抗体の存在は、これらの動物がウイルスにさらされているか、またはウイルスに感染していることを示していました。さらに、これらの発生はネパールの重要な野生動物地域またはその近くで発生しており、感染した犬や野生の肉食動物の集団が近くにあるため、病気が伝播する可能性が生じています。

これらの以前の研究は、イヌと野生の肉食動物の両方が CDV 感染にさらされたことを示唆していますが、ウイルスの RNA を遺伝的に配列した研究はありません。ネパールにおける CDV の進化的起源をより深く理解するために、私たちは 2018 年にカトマンズ盆地で野良犬で発生した CDV を遺伝学的に特徴付けました。また、多様な動物系統にわたる CDV 系統の系統解析に基づいて、肉食動物の間で CDV 循環のシルベートサイクルが継続している可能性を推測しました。世界中の国内および野生の CDV 宿主からの公的に入手可能な配列を分析することによって宿主を特定します。

私たちは、カトマンズ盆地で野良犬の CDV をスクリーニングするためにこの研究を実施しました (図 1)。私たちは、南にスーリヤビナヤク地域林が隣接するバクタプル地区の人口密集地域を選択しました (図 1)。スリヤビナヤク地域社会の森は、カトマンズ渓谷の南郊外にある連続した森林地帯であり、森林に覆われた丘陵にはヒョウ、ジャコウネコ、テン、小型ネコ科動物などの多くの野生の肉食動物が生息していることがわかります[17]。

バクタプル地区の中心部にある場所。カトマンズ渓谷の野良犬の CDV 株を検出および特徴付けるために犬の糞便サンプルが収集された場所

私たちは、カトマンズとバクタプルの地元の動物病院と提携して、2018 年初頭にサンプリングエリアの野良犬から侵襲的な生体サンプルを収集しました（表 S1）。地元の獣医師は、CDV感染が疑われる野良犬から採取して冷凍保存されていた保管サンプル（眼球、唾液、糞便、直腸綿棒）を提供した。これらの犬は、結膜炎、硬いパッド、鼻汁および眼漏、発作、または体のけいれんなどの犬ジステンパーの臨床症状を示しました。 18]。

また、バクタプル中心部の野良犬から非侵襲的な糞便サンプルも収集しました（図1）。私たちはバクタプル中心部の密集居住区で犬の糞便をサンプリングし、層別サンプリング計画を使用して地域のすべての部分から比例した数のサンプルを収集しました。私たちは、自治体が道路を清掃する前の午前7時から9時の間に道路内および道路沿いで新鮮な犬の糞をサンプリングしました。サンプル収集者はサンプルの汚染を防ぐために手袋とフェイスマスクを着用し、サンプリングごとに手袋を交換しました。滅菌綿棒を使用して糞便の外側の粘液層を軽くたたき、0.5mlのTrizol安定剤を満たした凍結バイアル中で回転させました。私たちは、さらなる処理が行われるまで、サンプルをネパールのイントレピッド研究所の -80 ℃の冷凍庫に保管しました。

サンプル（臨床スワブおよび糞便スワブ）をボルテックスして、Trizol 懸濁液中に細胞を均一に分散させました。 Direct-zol RNA MiniPrep キット (Zymo Research、米国) を使用して RNA 抽出を実行しました。 Invitrogen Superscript III (ThermoFisher、米国) を使用して RNA 溶出液から cDNA 合成を実行し、下流の処理まで -80 °C の冷凍庫で保存しました。

我々は、遺伝子の約 390 bp 領域を増幅するモルビリウイルス特異的プライマーセットを使用して、CDV リンタンパク質 (P) 遺伝子の PCR スクリーニングを実行しました [19]。 PCR アンプリコンを 1.5% アガロースゲルで視覚化し、ExoSAP-IT™ キット (Thermofisher、米国) を使用して増幅産物を精製し、ABI PRISM® BigDye を使用して MJ Research PTC-225 ペルチェサーマルサイクラーで配列決定反応を実行しました。 ™ Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems, USA) は製造元のプロトコールに従ってください。最後に、配列決定産物を ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) で解析し、P 遺伝子配列を使用して Genbank データベースに対してブラストツールを使用して CDV の存在を確認しました。

P 遺伝子を使用してサンプル中の CDV の存在を確認した後、プライマー 3 F/3R および 4 F/4R を使用したタイル化アンプリコン法 [20] を使用してヘマグルチニン (H) 遺伝子の一部 (約 852 bp) を増幅し、配列を決定しました。陽性サンプルの変異体の特徴付けに使用します。 H 遺伝子は、ウイルスと宿主細胞間の付着を仲介するウイルス表面糖タンパク質をコードします。この遺伝子はゲノムの他の部分よりも遺伝的多様性が高いため、ほとんどの研究で CDV の系統分類のマーカーとして使用されています [21]。

カトマンズの野良犬からの CDV 株の系統を特徴付けるために、研究のために収集したサンプル配列を現在知られているすべての CDV 系統と比較しました。我々は、1940年から2018年までに収集された、5大陸（オーストラリアと南極を除く）の少なくとも26か国に由来する245の完全長CDV H遺伝子配列（以下、「参照配列」と呼ぶ）のデータセットを編集しました（表S2）。このデータセットには、NCBI GenBank データベースで公的に入手可能な、イヌ科、ネコ科、イタチ科、アイルリ科、プロキオン科、クマ科の肉食動物ファミリーに属する宿主種からの、地理的に定義された 17 の異なる CDV 系統のワクチン株配列およびその他の配列も含まれています。 MUSCLE ver3.8.425 [22]を使用してすべての参照配列とカトマンズの犬のCDV配列をアラインメントし、アラインメントを視覚的に検査し、必要に応じてAliView ver1.26 [23]を使用して配列をトリミングおよび編集しました。系統樹の再構築のために、アライメントデータセットから jModeltest2 ver2.1.8 [24] のベイズ情報量基準に基づいて最適なヌクレオチド置換モデル (TVM + G) を選択しました。我々は、このモデルと MrBayes v3.2.7 [25] のベイズ推論法を使用して 2,000,000 回の反復で系統解析を実行し、2,000 回の反復ごとにサンプリングし、最初の 25% をバーンインとして破棄しました。 FigTree v1.4.4 [26] を使用して系統樹を視覚化し、注釈を付けました。

私たちは、バクタプル地区とカトマンズ地区の 2 つの動物病院に入院した症状のある犬 8 頭から臨床サンプルを入手しました。 8 頭の犬から、眼 (n = 7)、直腸 (n = 7)、唾液 (n = 1) のサンプルを含む、CDV を検査するための合計 15 のサンプルを採取しました。犬のうち 7 頭は、これらのサンプルの 1 つまたは複数で CDV 検査で陽性反応を示しましたが、1 頭の犬は眼と直腸の両方のサンプルで陰性でした。採取された合計 15 個のサンプルのうち、眼球サンプル 4 個と直腸サンプル 4 個が陽性反応を示しました。また、バクタプルの街頭から 44 個の糞便サンプルを収集しましたが、そのうち P 遺伝子 PCR スクリーニングで CDV 陽性反応を示したのはわずか 3 サンプル (6.8%) でした (図 1)。

我々は、カトマンズ渓谷の4頭の犬と1頭の犬の糞便から分離された5つのCDVサンプル（4つの臨床ソースと1つの糞便ソース）からH遺伝子の部分配列（約800 bp）を決定しました（表S1）。系統解析により、カトマンズ渓谷のイヌの CDV 株は Asia-5 系統として分類されました (図 2)。この系統には、インドのイヌ、ハクビシン (Paradoxurus hermaphroditus)、レッサーパンダ (Ailurus fulgens)、およびアジアのライオンから配列決定された CDV 株も含まれていました。

27 か国および 17 系統の 245 個の CDV 赤血球凝集素 (H) 遺伝子配列に基づいて構築された系統樹。これには、ネパールのイヌ (Canis lupus Familyis) から収集された 5 つのサンプルが含まれており、このクレードは薄赤色で強調表示されています。系統解析は、MrBayes のベイズ推論法を使用して、2,000,000 回の反復の実行、2,000 回の反復ごとにサブサンプリング、バーンインのためにサンプルの 25% を廃棄して実行されました。系統樹の先端は、宿主種/起源の科に基づいて色付けされています。一般的な CDV ワクチンは赤色、イヌを除くイヌ科は緑色、イヌ科は青色、イタチ科は紫色、ネコ科はオレンジ色、残りは黒色で強調表示されています。ベイズ推論により推定されたノードの事後確率値をツリー上に表示

CDV 系統は主に地理的地域に従ってクラスター化されていることがわかりました。各系統は、それぞれの地理的地域で共生する多様な肉食動物種から分離された系統で構成されていました。イヌ科およびイタチ科に属する肉食動物から分離されたウイルス株は、系統全体で最も一般的に発生するウイルス株でした。私たちのカトマンズ渓谷の犬サンプルが集まったアジア-5系統は、アフリカライオン、ブチハイエナ（Crocuta crocuta）、アフリカワイルドドッグ（Lycaon pictus）などのセレンゲティの地形の肉食動物から分離された系統からなるアフリカ-2系統の姉妹クレードです。、オオミミギツネ（Otocyon megalotis）、ジャッカル（Canis aureus）、飼い犬（図2）。

私たちの研究では、カトマンズ渓谷の犬のCDV株を、Bhattらによって2016年に初めて同定されたAsia-5系統として遺伝的に特徴付けました。 (2019) [2] インドの犬より。その後、同じ系統が、2018年にインド西部グジャラート州のギル国立公園でアジアライオンの致死的大発生の原因となる変異種であることも判明し、20頭近いライオンの死を引き起こした[6]。同じ株は、インドの他の地域のハクビシンとレッサーパンダでも確認されました [6、27]。カトマンズの犬で見つかったCDV株がインドの肉食動物で見つかったものと同じであるという事実は、アジア-5変異株がインド亜大陸地域、特にインドとネパールの保有宿主の間で蔓延している可能性を示唆している。同様の地域パターンが他の地域の他の CDV 株でも確認されています (図 2 に視覚化)。たとえば、African-2 変異株は、1985 年にタンザニアのセレンゲティ国立公園で 1,000 頭以上のアフリカライオンの死の原因であることが初めて特定されました [4]。同じ株はその後、流行調査中に野良犬、ブチハイエナ、オオミミギツネから分離され、数十年後にアフリカの野生犬やジャッカルからも再び検出された[28]。同様に、シベリアで死んだアムールトラとアムールヒョウから分離されたCDVの北極に似た変異体も、ロシアでの野生肉食動物の長期CDV監視研究中に、この地域全域のイタチ科動物の間で発見された[29]。

これらの研究は、類似または密接に関連する CDV 株が同所性肉食動物宿主間で地域的に循環していることを示唆しています。このことから、ネパールでウイルスに感染したヒョウやトラなどの野生肉食動物の CDV もアジア 5 系統に属する可能性があると考えられます [13]。 Bodgenerらによると、 (2023)、ヒョウの方がトラよりもイヌの捕食行動のレベルが高いことが、ヒョウの CDV への関連曝露レベルを増加させた可能性がある [13]。しかし、犬が唯一の寄与者ではなく、より複雑な貯水池群集の中で犬が小さな役割を果たしているだけである可能性もあります。ロシアでは、イタチ科のような野生の小型肉食動物が大型ネコ科動物の感染源である可能性が最も高いことが判明した。タンザニアでは、ライオンの集団発生時に犬が直接の感染源ではなかったとも判明した。ネパールは現在急速な開発段階にあり、その結果、都市化と野生動物の生息地の人為的侵入により、森林と都市空間の間のギャップが埋まりつつあります。マナンやチトワンなどの重要な野生動物地域の犬の間でCDVの罹患率が高いことが知られており、最近では人里に近いヒョウやトラの間でもCDVが蔓延していることが知られています。これらの発見は、家畜および野生の肉食動物の間で CDV の波及力学が存在するかどうかを確認するための今後の調査を正当化するものである。

CDV 系統樹 (図 2) から観察されるように、ほとんどの系統において、飼い犬が最も一般的な CDV 宿主または保有者です。これはおそらく、犬が最も観察/検査されやすいという事実によるものと思われます。研究によると、CDVは主に野生の肉食動物のグループ、おそらく本質的に比較的回復力のあるテン、ハクビシン、マングースなどの小規模な肉食動物のグループの間で維持されており[29、30]、後に発生する相互作用から野良犬に伝染することが示唆されている。野良犬は小型の肉食動物を攻撃したり捕食したりします。これは私たちの系統樹でも裏付けられており、すべての系統の中で 2 番目に多い保有宿主はイタチ科でした。系統発生データセット内のイタチ科の種は、ヨーロッパアナグマ (Meles meles)、フェレット (Mustela putorius furo)、アメリカミンク (Neovison vison)、キイロテン (Martes flavigula)、ブナテン (Martes foina)、フィッシャー ( Martes pennanti）、ヨーロッパケナガイタチ（Mustela putorius）、クロテン（Martes zibellina）、シベリアイタチ（Mustela sibirica）、アナグマ（Meles leucurus）（表 S2）。これらのイタチ科の動物は、主にアジア、ヨーロッパ、北米に分布しています。ギルバートらによる包括的な研究。 (2020) [29] は、シベリアの荒野のイタチ科の動物が、多宿主の肉食動物群集全体にわたるシルベート周期を介して局所レベルで CDV を維持している可能性があることを示唆しました。

ネパールのような野良犬の個体数が多い国では、犬はイタチ科のような小型の肉食動物と頻繁に交流（攻撃/殺害）し、その後大型の捕食動物の餌食になるため、CDVの媒介者となる可能性があります。これらの生態学的動態は、すでにさまざまな人為的要因によって脅かされている、小型肉食動物から野良犬、大型肉食動物、またはその逆への CDV の波及と感染の可能性を高めます [31]。カトマンズ盆地は、急速な都市化と野生動物の生息地への人為的な侵入が森林と都市空間の間のギャップを埋めつつあるため、CDV 波及力学が活発に進行している可能性があるその一例である。 2021年にカトマンズの西郊外地域で、成人の雄ヒョウがCDV感染と一致する臨床症状により死亡した[13]。ネパールのさまざまな地域でイヌ、ヒョウ、トラへの CDV 曝露を証明したこれまでの研究は、このサイクルが国内のほとんどの地域ですでに進行中のプロセスである可能性を示唆しています。そのため、ネパールの病気の疑いのある犬や野生の肉食動物のCDVを確認し特徴づけるためには、分子配列決定を使用したさらなる監視研究が必要です。肉食動物に加えて、有蹄動物やサルなどの種も過去に CDV に感染しており、監視する必要があります [11]。

監視活動のほとんどはイヌに焦点を当ててきたが、将来の監視プログラムでは、大型のネコ科動物やイヌ科動物だけでなく、イタチ科の動物、ビバリ科の動物を含む野生の肉食動物にも拡大することが不可欠である。犬が CDV の保有地で直接的な役割を果たしていないとしても、野良犬の数が管理されておらず増加していることは、捕食や病気の伝播、その他の手段を通じて野生生物に脅威をもたらす可能性があります。したがって、野生動物の保護が直面している課題に対処するには、犬の去勢手術とワクチン接種プログラムを実施することが重要です。

すべてのデータは原稿内に含まれています。この研究で生成されたヌクレオチド配列は NCBI Genbank に寄託されており、アクセッションは補足表 S1 にリストされています。

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リファレンスをダウンロードする

この研究を実施する許可を与えてくださった家畜サービス局、国立公園野生生物保護局、およびバクタプル市に感謝します。 CDV RT-PCR 検出とシーケンスのラボアッセイ開発中に私たちを指導してくださった Martin Gilbert 博士に感謝します。プロジェクトのさまざまな段階でサポートしてくれたCMDN、イントレピッド・ネパール、およびペット動物病院の獣医師のすべてのスタッフ、インターン、協力者に感謝の意を表します。

実験室での研究はネパール分子動力学センターによって支援され、フィールドでの研究は獣医師によるペット動物病院によって支援されました。この研究には外部からの資金提供は一切受けていません。

ネパール分子動力学センター、タパタリ、カトマンズ、ネパール

プラジュウォルマナンダール、ラジンドラナピット、サマン M プラダン、プラグン G ラジバンダリ、ジェシー A モラヴェク & ディベシュカルマチャリヤ

BIOVAC Nepal, バネパ, カブレ, ネパール

ラジンドラ・ナピット、サマン・M・プラダン、ディベシュ・カルマチャリヤ

ペットのための獣医動物病院、ガパリ、バクタプル、ネパール

プラナフ R ジョシ

カトマンズ動物病院および研究センター、タパタリ、カトマンズ、ネパール

リマ・D・シュレスタ

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PM、RN、JAM、DK が研究を設計しました。 PM、RN、JAM、PRJ、RDS がサンプルを収集しました。 RN と SMP はラボ分析を実施しました。 PM と PGR はバイオインフォマティクス分析を実行しました。 PM、RN、PGR、JAM、RDS が初期草案を作成し、レビューしました。著者全員が批判的に検討し、原稿を完成させました。

Prajwol Manandhar または Dibesh Karmacharya への通信。

著者らは、著者ガイドラインのページに記載されているように、ジャーナルの倫理基準が研究全体を通じて維持されたことを確認します。犬のサンプルは、病気の疑いの治療のために犬を連れてきたネパールのカトマンズとバクタプル地区の私立動物診療所から入手したもので、研究のために特別に調達された犬はなかった。バクタプルで犬の糞のサンプルを収集する許可は、関連する政府部門と自治体によって与えられました。

適用できない。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Manandhar、P.、Napit、R.、Pradhan、SM 他。カトマンズ渓谷の野良犬から採取した犬ジステンパーウイルスの系統学的特徴。 Virol J 20、117 (2023)。 https://doi.org/10.1186/s12985-023-02071-6

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受信日: 2023 年 2 月 5 日

受理日: 2023 年 5 月 14 日

公開日: 2023 年 6 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02071-6

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