ヒトミクログリアはアルツハイマー病において独特の転写変化を示す

Nature Aging (2023)この記事を引用

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脳の自然免疫細胞であるミクログリアは、アルツハイマー病 (AD) の進行に影響を及ぼし、潜在的な治療標的となります。しかし、ミクログリアは多様な機能を示し、その制御は完全には理解されていないため、治療法の開発は複雑になっています。アルツハイマー病に関連するトランスクリプトーム表現型と遺伝子調節ネットワークをより明確に定義するために、単核 RNA シーケンスの前に、12 人のアルツハイマー病患者と 10 人の対照ヒト背外側前頭前皮質 (男性 7 人、女性 15 人、いずれも年齢 > 60 歳) からミクログリア核を濃縮しました。今回我々は、確立されたミクログリア分子表現型とこれまで認識されていなかったミクログリア分子表現型の両方、観察されたトランスクリプトーム変化を引き起こす推定遺伝子ネットワークについて説明し、トラジェクトリー分析を適用してミクログリア表現型間の推定上の関係を明らかにします。私たちは、対照と比較してAD症例でより蔓延しているミクログリアの表現型を特定しました。さらに、恒常性マーカーを発現するミクログリアのサブクラスターの不均一性について説明します。私たちの研究は、ヒトのアルツハイマー病脳におけるミクログリアの詳細なプロファイリングにより、アルツハイマー病に関連するミクログリアの転写変化についての洞察が得られることを示しています。

アルツハイマー病 (AD) は、細胞外アミロイドベータ (Aβ) 斑、神経細胞内の神経原線維変化、および神経炎症によって病理学的に特徴付けられます。アルツハイマー病の病態の修正可能な特徴としての神経炎症への関心は、脳骨髄細胞によって独自に発現される遺伝子のコード領域および非コード領域に局在するアルツハイマー病リスクのバリアントを特定する遺伝子研究と併せて高まっています1。ミクログリアは脳に常在する自然免疫骨髄細胞であり、アルツハイマー病の病態生理学を促進すると仮説が立てられている神経炎症プロセスに寄与しています2、3、4、5、6、7、8、9、10。これまでの研究では、アルツハイマー病においては、ミクログリアが周囲のニューロンの挙動や機能に影響を与える炎症性メディエーターを放出し、グリアが神経保護機能を失い、シナプスやニューロンの異常な食作用を開始することが示唆されています3,7,11,12。ミクログリアは、モデル系におけるタウの拡散に寄与しているようであり 13,14 、抗体ベースの免疫療法アプローチに応答して観察される Aβ の減少など、Aβ 除去に関与する主要な細胞型である可能性があります 15。したがって、ミクログリアの炎症挙動は治療標的の設計に関連します。しかし、アルツハイマー病脳におけるミクログリア反応の理解には大きなギャップが残っています。

ミクログリアの表現型は、形態、生理学、遺伝子またはタンパク質の発現パターンによって区別されます。モデルシステムで行われた実験は、これらの不均一な特徴が特定の機能的ミクログリア表現型と関連している可能性が高いことを示唆しています10、16、17、18、19、20、21。成人の脳内、特にアルツハイマー病などの特定の疾患状態におけるミクログリア表現型の不均一性については、あまり知られていません。新鮮および凍結したヒト皮質組織の単細胞および単核 RNA シーケンス (snRNA-seq) 研究により、アルツハイマー病およびその他の脳の病態における複数のミクログリアの転写表現型が明らかになりました 22,23,24,25,26,27,28。 29. トランスクリプトーム的に異なるクラスターを区別することにより、特定の細胞の挙動を制御する遺伝的およびエピジェネティックな因子の候補を同定することが可能になり、精密な治療アプローチに活用できる可能性があります。ただし、標準的な snRNA-seq 法では、個体ごとに少数のミクログリアが含まれることがよくあります。細胞数が少ないと、ミクログリアの転写表現型の全範囲をマッピングする能力が低下し、クラスターまたはサブクラスター内の疾患関連遺伝子発現変化を特定する能力が制限される可能性があります。私たちは、個々のサンプルごとにはるかに多くのミクログリアを含むデータセットを使用することで、ミクログリアの転写表現型のさらなる細胞プロセスと調節因子が明らかになると仮説を立てました。

我々は、snRNA-seqのミクログリア濃縮技術としてPU.1の蛍光活性化核選別（FANS）を採用しました。骨髄マーカー PU.1 は、シーケンスを使用したトランスポザーゼにアクセス可能なクロマチンのアッセイを使用してミクログリアのエピジェネティクスの研究を強化するために使用されており 30、本研究では RNA シーケンス (RNA-seq) に適用されました。このアプローチにより、被験者あたり数千のミクログリアからの単核トランスクリプトームプロファイルの取得が容易になりました。われわれは、アルツハイマー病の有無にかかわらず22人のコホートからミクログリアの転写プロファイルを生成したため、ミクログリアクラスターにもっともらしい生物学的役割を注釈し、アルツハイマー病と対照の個体間のミクログリアの違いを特定できるようになった。このデータセット内の多数のプロファイルにより、遺伝子発現プロファイルに基づいて通常「恒常性」と注釈が付けられるミクログリアクラスター内の AD 特異的サブクラスターを特定することもできました 22、25、26、29。以前の報告で記載された恒常性および炎症性の表現型に加えて、アルツハイマー病の病因についてさらなる洞察を与える可能性のあるトランスクリプトームプロファイルを備えたミクログリアの表現型を明らかにしました。これらの発見は、アルツハイマー病におけるミクログリアの役割に関する将来の研究において仮説を検証するための新しい道を提供します。

骨髄特異的転写因子PU.1の発現のためにFANSを使用して、死後のヒトの脳から単離した核のミクログリアを濃縮しました（拡張データ図1a、b）。 PU.1 FANS が有効であることを確認するために、PU.1 FANS を使用した場合と使用しない場合の核を単離して配列決定しました (n = 4)。ソートされていないデータセット（46,085; 拡張データ図 1c）と PU.1 ソート済みデータセット（41,488; 拡張データ図 1d）の同様の数の総核を分析しました。 PU.1 で分類されたデータセットには、C3、CD74、C1QB、CX3CR1、および SPI1 の高発現によって定義されるミクログリア核 (23,310 ミクログリア核) が、分類されていないデータセット (1,032 ミクログリア核) よりも 20 倍多く含まれていました。 PU.1 で分類されたデータセットで観察されたミクログリア核も、より多くのミクログリアクラスターによって証明されるように、さらなる複雑性を示しています (拡張データ図 1d)。

次に、PU.1 FANS を 22 人のコホートに適用しました (図 1a)。 PU.1 FANS 後のサンプルは、さまざまな非骨髄性細胞タイプを保持していますが (図 1b)、明確なクラスターの解像度が得られ、明確なミクログリア遺伝子発現パターンが示されています (核の 63%、図 1c)。初期データセットは 205,226 個の核で構成され、200,948 個の核 (98%) が品質管理とダブレット除去に合格しました。細胞型マーカー遺伝子の遺伝子発現は、データセット内でミクログリアとして識別されたクラスター（1、2、3、7、16、および17、図1d）がミクログリアマーカーの発現が高く、他の細胞型の標準マーカー遺伝子を発現していないことを示しています。。したがって、200,948個の核のうち、127,371個がミクログリアとして同定され（図1dおよび拡張データ図2）、個体あたり平均5,790個の核が存在した。このデータセットは、代替エンリッチメント技術を使用した他の公開データセットと比較した場合も含め、これまでに生成されたサンプルデータセットあたり最大のミクログリアです。ミクログリア (拡張データ図 2) と星状細胞または末梢単球マーカー (拡張データ図 3) の両方の詳細な遺伝子発現プロットは、すべてのサブクラスターにわたるミクログリアサブセットデータセットにおけるミクログリア遺伝子の高い発現と、他の細胞型および末梢細胞の欠如を示しています。マーカー。

a、22個の死後ヒト背外側前頭前皮質の実験デザイン（一部BioRenderで作成）。 b、22 人の被験者データセットからの PU.1 で分類された核の UMAP は、ニューロン、星状膠細胞、希突起膠細胞 (Olig) およびその前駆細胞 (OPC) ならびに内皮細胞を含む他の細胞型が存在するにもかかわらず、6 つのクラスターが存在することを示しています。、最大の 3 つを含む、ミクログリア核で構成されています。 c、ミクログリア (CX3CR1) について、代表的な細胞型マーカー遺伝子 (x 軸) と、各クラスター (y 軸に沿って分布) 内の遺伝子を発現する核のパーセント (ドットのサイズ) および平均発現レベル (色の強度) が表示されます。各クラスターの星状細胞 (GFAP)、ニューロン (MAP2)、OPC (COL20A1)、Olig (ST18)、および内皮細胞 (ITIH5)。 d. より広範な細胞型マーカー遺伝子セットの遺伝子発現は、クラスター 1、2、3、7、16、および 17 がミクログリアで構成されていることを示しています。 IHC、免疫組織化学。

ミクログリア様発現を有する127,371個の核のクラスター分析により、クラスターを他のすべての核と比較して、発現差のある遺伝子（DEG）を特徴とする10個のクラスター（図2a）が同定されました（図2b）。遺伝子セット濃縮分析（GSEA）を使用して、各クラスター内の生物学的経路の濃縮を決定しました（図2c）。各クラスターを定義する DEG や GSEA によって特定された生物学的経路には重複がほとんどなく、各クラスターの独自性を裏付けています。

a、22サンプルのデータセットからのミクログリアの基準を満たす6つのPU.1ソートクラスター（図1dに示す1、2、3、7、16および17）からの核上の不偏クラスタリングのUMAPには、10個のミクログリアクラスターが含まれています。 b. 各クラスターを他のすべてのクラスターと比較した差次的発現分析により、それぞれの異なる遺伝子発現プロファイルが示されます。各クラスターの上位 25 個の遺伝子が、右側に注釈が付けられた遺伝子名とともに表示されます。クラスター 1 は、標準的なミクログリア遺伝子 (CX3CR1 および P2RY12) の発現が高くなります。 c、各クラスターをクラスター 1 (「恒常性マーカー」) から区別する遺伝子の GSEA 分析は、異なる生物学的経路を示唆しています。 d、ミクログリアデータセットにおける正規のミクログリアマーカー遺伝子発現と、PU.1 濃縮中にソートされた他の細胞タイプとの比較は、10 クラスターにおけるミクログリアマーカー遺伝子発現の濃縮を示しています。 NES、正規化されたエンリッチメントスコア。

まず、人間の脳で以前に報告されたミクログリア表現型に類似した注釈を持つクラスターを発見しました。我々は、CX3CR1およびP2RY12の高発現を含む恒常性遺伝子が豊富なクラスターとして、最大のクラスターであるクラスター1を同定した（参考文献19、24、25、26）。我々は、この恒常性マーカー発現クラスターを「HM」と略称しました。 HM は、他のクラスターの DEG を評価するための比較の基礎として確立され、以前の出版物 22、25、26 (補足データ 1) のアプローチを再現しました。クラスター4には、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病のKEGG経路を含む、アポトーシス、インターフェロンガンマ（IFN-γ）への反応、ミトコンドリアおよび呼吸機能に関与する経路が豊富でした（図2c）。このクラスター内で最も DEG が高いのは FTL です。総合すると、クラスター 4 のプロファイルは、変性またはジストロフィーの表現型を示唆しています 12,26。クラスター 7 は、移動と運動性に関与する遺伝子の発現によって特徴付けられました (図 2b)。クラスター 7 に豊富な経路には、膜組織と運動性が含まれていました (図 2c)。クラスター 8 は、NFκB1、RELB、IL1β などの古典的な炎症活性化遺伝子の発現を伴う標準的な炎症表現型を特徴としていました (図 2b)2、31、32。 GSEAは、このクラスターにはNFκBシグナル伝達、インターフェロンシグナル伝達、Toll様受容体（TLR）シグナル伝達、およびRIG-I媒介シグナル伝達経路が豊富であることを明らかにし、刺激に対する下流のエフェクター炎症反応を示しています（図2c）。クラスター 8 に関連する追加の遺伝子オントロジー (GO) 用語には、脂質合成と局在化が含まれていました。クラスター9は、CDKN1A、CEBPB、ZFP36、FTL33など、老化、鉄恒常性、サイトカイン産生に関与する遺伝子と経路によって定義されます（図2b）。このプロファイルは老化ミクログリアを示唆しています 34。クラスター 10 は、細胞周期制御と DNA 修復に関与する遺伝子の発現によって定義されます 35,36 (図 2b)。クラスター10に豊富に含まれる経路は、細胞周期プロセスに関与する遺伝子の相対的な増加と、エンドソームおよびサイトカインプロセシング遺伝子の減少を確認します（図2c）。さまざまな活性化表現型と非活性化表現型のミクログリアについて予想されたように、P2RY12などの遺伝子は発現が異なりましたが、C3やCD74などのミクログリア遺伝子はミクログリアサブクラスター全体でより類似した発現を示しました（図2d）。

次に、人間の脳ではこれまでに報告されていない 3 つのクラスター (クラスター 3、5、6) を発見しました。これらのクラスターは、エンドリソソームネットワーク (ELN) 遺伝子発現と、HM ミクログリアと比較した ELN 経路シグネチャーの濃縮によって区別されました。したがって、それらをまとめて ELN として注釈を付けます。クラスター 3 は、凝集タンパク質の内部移行 (図 2b)19、20、24、25、26、37、食作用および小胞媒介輸送 32 に関与する遺伝子によって定義されます。クラスター 3 に豊富に含まれる経路には、エンドソームおよびリソソーム経路、異化作用および脂質結合が含まれますが、炎症プロセスは含まれません (図 2c)。解糖に関与する遺伝子はクラスター 3 で発現が低く、他の 2 つの ELN クラスターと区別されており、これらの細胞がミクログリアの炎症表現型で観察される解糖への代謝スイッチを受けていないことを示唆しています 38。クラスター 5 および 6 は ELN サインを示しましたが、それらはまた、明確な炎症特性を備えて代謝的に活性であるように見えました。クラスター5では、他の熱ショックタンパク質遺伝子に加えて、HSP90AA1、HIF1A、BAG3の発現が増加しており（図2b）、これらの細胞が外部ストレスに応答していることを示唆しています。解糖を駆動する遺伝子も HM と比較してクラスター 5 で高く、これらの細胞における解糖への切り替えを反映している可能性があります 38。このクラスターに豊富に含まれる経路は、このクラスターがエンドサイトーシス、オートファジー、およびマイトファジーにおいて活性であることを示しています (図 2c)。クラスター6は、クラスター5と同様の代謝活性遺伝子とストレス応答経路を特徴としていますが（図2c）、有意に高いレベルのIRF3、IRF5、およびIRF7によって示唆されるインターフェロンシグナル伝達の追加成分を伴います。クラスター 6 はまた、サイトゾル DNA/RNA 認識および IFIT2、IFIT3、TRIM22 (参考文献 39) を含む抗ウイルス遺伝子、ならびにパターン認識受容体 CARD9 および NLRP3 インフラマソームのメディエーターの発現増加を示しました31、32、40、41、42。、43。注目すべきことに、クラスター 6 に特有のこととして、DNA 修復遺伝子 ATM および RNASEH2B の発現が低いことがわかりました。 IL1βはHMと比較してクラスター6で増加していましたが、より標準的な「炎症」クラスターであるクラスター8ではさらに高いレベルのIL1βとNFkB1などの他の炎症性エフェクター分子の発現が見られました。クラスター 6 に富む経路は、NOD 様受容体 (NLR) シグナル伝達の富化など、危険に関連する分子パターン刺激に対する上流の炎症反応もサポートします。さらに、代替方法を使用して生物学的経路とそれらの間のリンクを特定し、クラスター 3、5、および 6 の ELN 機能の検証を提供しました (拡張データ図 4)。ネットワーク内の各ノードの存在を決定する遺伝子を含む補足テーブルは、Synapse で入手できます。

AD44 のリスクと進行における APOE の役割にもかかわらず、現在まで、特定の APOE 遺伝子型を持つ個人におけるミクログリアの状態を定義した研究はありません。私たちのサンプルのほとんど（13/22）が APOE ε3 対立遺伝子のホモ接合性であったため、完全に APOE ε3/ε3 個体（対照 7 名と AD 病理 6 名、女性 9 名と男性 4 名、ミクログリア 75,018 名）から構成されるデータセットのサブセットを生成しました。核）。再正規化と再クラスター化の後、ミクログリアの 9 つのクラスターを特定しました (拡張データ図 5a)。これらのクラスターは、混合 APOE 遺伝子型データセットのクラスターを定義したものと同様の遺伝子によって定義されました (拡張データ図 5b および補足データ 2)。ほとんどのクラスターで、DEG は混合 APOE データセットの DEG と非常に似ている (約 60% 以上の一致) ことがわかりました (拡張データ図 5c)。 HM、神経変性、炎症、細胞周期、およびエンドリソソームのクラスターは、混合 APOE コホートのものと類似していました。これは、APOE 遺伝子型を制御している場合でも、ヒトの脳には複数の異なる ELN ミクログリアクラスターが存在することが一般的であることを示唆しています。

データセット内の集団の制御ネットワークを特徴付けるために、各ミクログリアクラスターで遺伝子発現を制御する上位の転写因子駆動ネットワーク (レギュロン) を特定しました (図 3)。各クラスターは特定のレギュロンのセットによって定義され（図3a）、各クラスターを特徴付ける差次的な遺伝子発現が転写制御機構によって決定されるという仮説を裏付けています。さまざまなクラスターで遺伝子発現を促進すると予測されるレギュロンの多様性を実証するために、クラスター 3、クラスター 5、クラスター 6、およびクラスター 8 を強調表示します (図 3b)。これらのクラスターのそれぞれは、分析の順列にわたって繰り返しそのクラスターのトップ 10 の 1 つとして現れる、異なるレギュロンのセットを示しています。たとえば、クラスター 5 は、解糖系およびエンドリソソームの表現型をクラスター 6 と共有しますが、クラスター 6 で予測されるインターフェロン応答因子レギュロンを共有しません。さらに、標準的な「炎症性」エフェクタークラスターであるクラスター 8 では IRF1 および NFKB2 レギュロンが観察されました。クラスター 6 では追加の (そして異なる) インターフェロン応答因子レギュロンが観察されました。他のクラスターの上位レギュロンも互いに異なります (拡張データ図 6)。抗炎症遺伝子調節に関連する転写因子である MAFB は、クラスター 3 のリストのトップでした (参考文献 16)。対照的に、一般に抗ウイルス応答に関連する転写因子によって指示されるレギュロン、IRF7、および程度は低いですが IRF3 はクラスター 6 のリストのトップであり、これらの細胞は核酸認識およびエンドリソソーム経路も豊富であるという観察と一致しています (図3b)。個人のAPOE ε3/ε3 サブセットの上位レギュロンは、より大きなデータセットに記載されているものと同様の独特の多様性を示しており、APOE 遺伝子型間の相同性を再度示唆しています (拡張データ図 7)。これらの推定された遺伝子ネットワークとその転写因子レギュロンを総合すると、ここで特定されたクラスターの多様性が実証され、今後の研究で調査される可能性のある制御標的が提供されます。

a、SCENIC ワークフローにより、ミクログリアのさまざまな表現型クラスターに関連する転写因子調節ネットワークが特定されました。転写因子（クラスター内のレギュロン活性）の曲線下面積（AUC）のヒートマップ。 b, 転写因子レギュロンがクラスターあたりの上位 10 位のレギュロン特異性スコアに含まれる例のパーセンテージ (27 の順列のうち)。色が濃いほど、複製の割合が高いことを示します。

定義された刺激を用いたモデル系での実験により、ミクログリアが多様な表現型を獲得する可能性が実証されました。しかし、生体内でヒトミクログリアが獲得する進行と表現型のスイッチを理解することは困難です。我々は、単核データセットを使用して、Monocle3 (参考文献45) 軌道推論法を使用してミクログリアのトランスクリプトーム遷移を調査しました(図4)。仮説生成の演習として、どのクラスターが終了状態と遷移状態になるかを尋ねました。得られた分岐軌跡は、恒常性遺伝子発現が豊富なクラスターであるHMから複数の遷移状態が放射状に広がっていることを示唆しており、モデル研究で予測されているように、「恒常性」ミクログリアがヒトにおいて複数のエンドポイント表現型に移行する可能性があるという仮説を裏付けている10、16、17。 DEG と GSEA だけを調査した場合にはすぐには明らかではなかったクラスター間の関係が見つかりました。軌跡解析により、細胞の進行がオートファジーストレスELNクラスター（クラスター5）または炎症性ELNクラスター6のいずれかに継続する分岐点が明らかになりました（図4）。クラスター 5 は老化様クラスター (クラスター 9) に隣接しており、オートファジーと老化が関連する生物学的経路およびエンドポイントであるという概念と一致しています。 Nguyen らの研究 26 と同様に、運動性クラスター (クラスター 7) も別のエンドポイントです。

ミクログリアデータセットに適用された単核軌道推論は、複数の表現型オプションがクラスター 1 から外側に放射状に広がっていることを示しています。各分岐にはいくつかの潜在的な終点があり、ミクログリアは単一段階の直線軌道に沿って進行するのではなく、代わりにいくつかの遷移状態の 1 つを経て、次の状態に進む可能性があることを示唆しています。さまざまなトランスクリプトーム末端表現型に到達します。

恒常性マーカー発現クラスターと標準炎症クラスター (それぞれ HM とクラスター 8) はいずれも、AD 脳と対照脳の両方で同等に表されました。対照的に、クラスター6には、データセットで予想されるよりも多くのAD核が含まれていることがわかりました（調整済みP = 0.006）。これは、AD関連プロセスがこのクラスターのプロファイルに表されている可能性があることを示唆しています（図5a）。複数のアルツハイマー病ゲノムワイド関連研究により、ミクログリアまたは骨髄細胞で発現される遺伝子に関連するリスク対立遺伝子が特定されています4。アルツハイマー病リスクの変化に関連する一塩基多型遺伝子座の 46 個の遺伝子のリストを使用し 44,46、我々は GSEA を使用して、同定された 10 個のミクログリアクラスターにおけるこれらの遺伝子の濃縮度を評価しました。他のすべてのクラスターと比較して、クラスター6ではより多くのADリスク遺伝子が差次的に発現していることが観察されました（調整済みP < 0.001）。 PICALM、SORL1およびPLCG2の遺伝子発現は、クラスターの残りの部分と比較してクラスター6で有意に低かったが、APP、APOEおよびBIN1を含む他の遺伝子の発現は有意に高かった（すべて調整済み P < 0.001;図5b）。 ELN遺伝子の代替セットを使用して、クラスター6での有意な差次的発現を実証しましたが、TLR関連遺伝子はクラスター8でより多くの場合高度に発現されました（拡張データ図8a、b）。「疾患関連ミクログリア」に関連する遺伝子は、AD マウスモデルで観察された単一クラスターとは対照的に、複数のクラスターにわたって豊富でした 19 (拡張データ図 8c)。我々はさらに、健康な老化に存在するミクログリア表現型がAD脳で減少しているかどうかを調査した。細胞周期調節遺伝子を差次的に発現するクラスターであるクラスター10は、AD脳と比較して対照脳で大きいことが判明した（混合APOE調整P <0.001およびAPOEε3/ε3調整P <0.001;図5a）。クラスター 10 はデータセット内で最小のクラスターであるため、レプリケーションに値します。しかし、これらのデータは、ADの病態には、細胞周期およびDNA修復遺伝子が豊富なミクログリアクラスターの検出可能な減少が関与している可能性があることを示唆しています。

a、クラスター 6 は AD 脳で有意に増加しています (カイ 2 乗 FDR 補正 P = 0.0064)。一方、クラスター 10 は対照 (Ctrl) サンプルで増加しています (カイ 2 乗 FDR 補正 P = 0.0006)。 b、ミクログリアクラスター全体にわたる AD 関連リスク遺伝子発現のヒートマップは、クラスター 6 でより強い差次的発現を示します。 c、ミクログリアにおけるリソソーム形態の不均一性の実証。 AD 症例の代表的な画像は、形態と Lamp-1 シグナルの不均一性を伴うミクログリア (Iba-1、緑色) を示しています。例としては、枝分かれした (上の矢印) およびより大きなリソソーム (Lamp-1、マゼンタ) シグナルと、「活性化された」またはあまり枝分かれしていない表現型 (下の矢印) があります。 d、AD症例のクラスター6マーカーであるPTGDS（赤）発現が高い代表的なミクログリア（Iba-1、緑）。 e、AD症例のクラスター6マーカーであるP2RX7（マゼンタ）の発現が高い代表的なミクログリア（Iba-1、緑色）。 f、AD症例における多数のリソソーム（Lamp-1、白）とサイトゾルdsDNA（赤紫）の両方を有する活性化ミクログリアの代表的な例。 c〜fのすべての代表的な画像には、複数のフィールドと少なくとも3つの人間の脳で複製された染色が表示されます。すべてのスケールバーは 15 μm を表します。 **P < 0.01 を修正。

トランスクリプトームデータは、高齢の対照脳と AD 脳の両方におけるミクログリアエンドリソソーム表現型の不均一性を予測します。リソソームマーカーであるLAMP1の免疫染色により、リソソームのサイズと数が異なるさまざまなリソソーム表現型が明らかになりました（図5c）。クラスター6マーカーを発現するミクログリアは、サブクラスターで高度に発現されている遺伝子であるPTGDS（図5d）およびP2RX7（図5e）のタンパク質産物の免疫標識によってAD脳で同定されました。クラスター 6 とクラスター 8 のミクログリアは両方とも、DNA/RNA 分子の検出に関与する遺伝子の発現差を示しており、ミクログリアがサイトゾル核酸への曝露によって活性化される可能性があることを示唆しています。ミクログリアにおけるサイトゾル核酸の存在を評価するために、二本鎖DNA（dsDNA）についてミクログリアを免疫標識しました（図5d）。我々は、dsDNAに対して免疫反応性を持つミクログリアには拡大したリソソームも含まれているのに対し、同じ組織切片にある他のミクログリアは正常なリソソームサイズを持ち、dsDNAに対して免疫反応性を持たないことを観察しました（拡張データ図9）。これらの発見は、遺伝子発現パターンに反映されるミクログリアの不均一性が、ヒト組織で検出できる形態学的表現型を表す可能性があることを示唆しています。

我々は、ヒトの脳の分子プロファイルに関連する既知の炎症性変化を考慮すると、アルツハイマー病および老化した脳組織の分極化した部分集団を研究する際に、アルツハイマー病特有のサインを検出するのは困難である可能性があると推論しました。私たちは HM 内の複雑さに注目しました。以前に報告されたように、我々は、HM が最大の集団であり、AD と高齢の対照脳サンプルにおいて比例的に類似していることを観察しました 22、25、26。この集団は、恒常性を維持するミクログリア内の遺伝子発現に対する AD の影響を理解するために広範囲に特徴付けられていません。私たちのデータセットは、恒常性マーカーが豊富な 50,000 個を超えるミクログリアを研究し、HM ミクログリア集団内のサブクラスターの検出を可能にしました。 HMミクログリアをサブクラスター化すると、異なる遺伝子発現を持つ7つの集団が明らかになりました（図6a）。私たちは、より大規模なミクログリアデータセットとは対照的に、AD 症例にほぼ固有のサブクラスターが存在することを発見しました。このAD特異的ミクログリアサブクラスターであるサブクラスター1.5（図6b）は、ほぼ独占的にADミクログリアで構成されており、AD病理によって独自に駆動されている可能性があることを示唆しています（調整済みP <0.001）。対照的に、サブクラスター 1.4 は対照核によって過剰に表されました (図 6b; 調整済み P < 0.05)。 HM サブクラスターは P2RY12 の高い発現を示し、サブクラスター 1.5 で最も高い発現を示しました (図 6c)。 HM サブクラスター 1.5 の他の遺伝子発現マーカーは、DEG WIPF3、PDE4B、および KCNIP など、より特異的でした (図 6c)。これらのサブクラスターに表される推定上の生物学的プロセスの特徴付けを開始するために、上記のように GSEA を実行しました。サブクラスター 1.5 は、細胞の運動性とカルシウムシグナル伝達に関与する遺伝子の濃縮という独特のプロファイルを持っていました（図 6d）。免疫組織化学を使用して、ヒトAD脳のミクログリアにおける二重陽性の高いP2RY12およびPDE4Bタンパク質発現の存在を検証しました（図6e）。さらに、すべての APOE ε3/ε3 個体のコホートでもこれらの結果を検証しました。我々は再び、恒常性遺伝子発現が豊富なミクログリアクラスターが、異なる遺伝子発現を有する複数の集団に分割できること、そしてそのようなクラスターの1つがAD症例で豊富であることを確認した（拡張データ図10）。

a、クラスター 1 恒常性マーカーミクログリア (HM) のサブクラスター化により、差次的な遺伝子発現によって定義される 7 つのサブ集団が明らかになりました。 b、サブクラスター 1.5 は AD 脳サンプルで大幅に拡大します (カイ 2 乗 FDR 補正 P = 6.2936 × 10−13)。一方、サブクラスター 1.4 は対照 (Ctrl) 脳サンプルでは増加します (カイ 2 乗 FDR 補正 P = 0.0194)。。 c、P2RY12の遺伝子発現は、HMサブクラスター全体で高い発現を示し、サブクラスター1.5で最も高い発現を示します。サブクラスター 1.5 で差次的に発現される遺伝子 (WIPF3、PDE4B、KCNIP など) も高い発現を示します。 d、サブクラスター 1.5 の経路濃縮は、運動性、イオンチャネル活性、およびニューロン関連プロセスの独自の濃縮を示しています。 e、免疫組織化学により、AD脳における二重陽性の高P2RY12発現ミクログリアおよびPDE4B発現ミクログリアの存在が検証される。代表的な画像には、複数の領域と少なくとも 3 つの人間の脳で複製された染色が表示されます。スケールバー、25 μm。 *P < 0.05 を修正。 **P < 0.01 を修正。規制、規制。

この研究では、高齢者の脳から 10 個の異なるミクログリアクラスターが特定されました。これらには、以前に記載された恒常性、老化、炎症性ミクログリアの転写表現型のほか、転写仕様の追加クラスターが含まれており、ADの病因への洞察を与え、仮説生成のプラットフォームを提供する可能性があります。我々は、エンドリソソーム遺伝子特徴を持つミクログリアクラスターの多様性について説明します。そのうちの 1 つは核酸認識遺伝子とインターフェロン制御遺伝子が豊富です。推定された遺伝子ネットワークは、個々のクラスターが異なる転写因子によって駆動されると予測しており、クラスターの機能的多様性をさらに裏付けるものとなります。軌道推論分析を使用して、ミクログリア表現型の遷移を観察し、実験的にテストできる関係を予測しました。アルツハイマー病の症例は、カルシウムの活性化、損傷への反応、および運動経路に関与する遺伝子の転写の変化を特徴とする恒常性遺伝子を発現するサブクラスター（サブクラスター 1.5）の出現によって区別されました。

エンドリソソームの機能は病的なタンパク質の輸送と分解に重要であり、ELN の機能不全は AD の発症に関与しています。特に AD ミクログリアにおける ELN 機能不全の影響についてはあまり知られていません 47。この研究では、ELN 成分の発現によって区別される 3 つのミクログリアクラスター (クラスター 3、5、6) が特定され、それぞれがエンドサイトーシス、小胞輸送、エンドリソソームおよびオートファゴソーム経路の遺伝子発現の異なるパターンを持っています。ミクログリアのエンドリソソーム機能の障害は、不十分なアミロイドクリアランスを通じてアルツハイマー病の発症に寄与すると考えられています1,47。しかし、骨髄細胞の ELN は、TLR やインターフェロンシグナル伝達の開始など、外来微生物の同定と処理においても重要な役割を果たしています 31,48。クラスター 6 (AD 症例で多く見られるサブタイプ) の遺伝子発現は、リソソームおよび小胞の機能に関与する遺伝子の発現が豊富であり、それに付随してインターフェロン制御因子およびインフラマソーム活性化遺伝子の発現が増加することを特徴としていました 40、42、49、50。ヒトアルツハイマー病には単一の「DAM」表現型はありませんが、ジストロフィーまたは標準的な炎症表現型とは異なる 1 型インターフェロン応答クラスターが観察されました 18、19、37、51。我々は、ここでの IRF 発現は、ミクログリアまたは隣接細胞からの核酸を含む、危険に関連する分子パターン分子への曝露を反映しているのではないかと仮説を立てています。この仮説は、サイトゾル dsDNA およびアメーバ様形態に対する免疫反応性を持つミクログリアの観察によって裏付けられています (図 5)。これらの発見は、アミロイド原線維が核酸を含み、ミクログリアで I 型インターフェロン応答を誘導し、シナプス喪失につながることを実証するマウスおよびインビトロの研究と一致しています 50。 Song ら 49,52 は、核 DNA がサイトゾルに放出された後の核酸分解および DNA 損傷に対するインターフェロン応答における ELN の重要な役割を報告しており、これは我々がここで述べる表現型と一致している。クラスター 6 ミクログリアは、AD 症例の集団として増加しただけでなく、AD の遺伝的リスクに関連する多数の遺伝子の有意な発現差も示しています (図 5)。この観察は、炎症細胞の機能不全がアルツハイマー病リスクの重要な要因であるという仮説を支持し、クラスター6で表されるミクログリアのサブタイプが治療介入の標的となるミクログリアのサブタイプである可能性を示唆しています。

私たちはデータセットを活用して軌跡法を適用し、ミクログリアの転写表現型間の潜在的な関係を推測しました。ジストロフィー (クラスター 4) クラスターと老化 (クラスター 9) クラスターが「最終状態」として出現し、計算による軌跡推論がどのようにして以前の経験的データからの予測と一致してミクログリアの表現型をマッピングできるかを示しています 10,16,17。それにもかかわらず、すべてのバイオインフォマティクス分析と同様に、これらの結果は仮説を生成するものとして見なされるべきです。軌跡解析では、オートファジーストレスと炎症性 ELN クラスター (それぞれクラスター 5 とクラスター 6) がクラスター 1 からの分岐点であることも示しました。あるいは、クラスター 3 は、恒常性クラスターと運動性クラスターまたはジストロフィー性クラスターの間の移行段階であるように見えました。。これらの発見は、Nguyen らによる以前の報告に似ています 26。私たちの分析により、各クラスターの遺伝的調節因子が特定され、これらのデータを合わせて、ミクログリア表現型の可塑性または可逆性をテストするさらなる研究の指針として使用できます53。さらに、最終分化した他の細胞型とは異なり、ミクログリアがトランスクリプトーム状態に出入りする可能性があり、これは組織オミクスの「スナップショット」性質を強調している。

われわれは、恒常性マーカー発現クラスターであるクラスター 1 内で、AD に特異的なミクログリアの表現型であるサブクラスター 1.5 を検出しました。「恒常性」という呼称は、ミクログリアの活性化により発現が減少するため、恒常性と呼ばれる遺伝子を発現するクラスターを表すためによく使用されます。これらの遺伝子が、活性化または損傷した細胞をより反応性の低い状態に戻すよう指示したり、特定の状態を維持したりする上で本当に積極的な役割を果たしているかどうかは不明です。それにもかかわらず、我々は、典型的な恒常性マーカーを使用して「恒常性」として同定されたクラスターが、アルツハイマー病の病態に反応した初期または微妙なミクログリアの変化への手がかりを保持している可能性があるミクログリアプロファイルの複雑さを裏切っていることを発見した。一例として、サブクラスター 1.5 は、P2RY12 の最も高い発現と、別の活性層を示唆する遺伝子の発現を示します。注目すべきことに、P2RY12は活性なミクログリアの表現型に関連しており、炎症時の運動の初期段階に必須であると考えられています54。サブクラスター 1.5 で最も高度に差次的に制御されている遺伝子は、認知機能 55 および骨髄細胞の炎症活性化に関係するホスホジエステラーゼである PDE4b です 56,57。 PDE4b は cAMP のレベルを調節し、ミクログリアの監視行動を調節することが示されています 58。サブクラスター 1.5 はまた、運動性およびカルシウムシグナル伝達経路の強化を示しており、これはニューロン活動またはミクログリアプロセスの拡張に対する応答を示唆している可能性があります 53。したがって、サブクラスター 1.5 は、病理学的タンパク質に応答した初期または微妙なミクログリアの表現型変化を表すが、免疫学的に完全に活性化された表現型ではないのではないかと推測します。

すべての snRNA-seq 研究と同様に、私たちの研究にも限界があります。 PU.1 ソーティングは、個々の被験者レベルで表現型の解像度を高めるためにミクログリア核を増やす方法を提供しますが、特定のミクログリア集団を選択する可能性があります。さらに、細胞に注釈を付けるために使用される既知のミクログリアおよび末梢骨髄系マーカーはミクログリアの指定の信頼性を高めましたが、含まれる核が異なる脳骨髄系細胞タイプである可能性は依然としてあります。同じデータによって定義されたクラスターを使用して識別された DEG は、必ずしも適切に制御されているとは限りません 59。ただし、私たちのデータセットにより、将来的には他のユーザーが私たちのクラスターを使用してこれを軽減できるようになります。各被験者からのミクログリアの総数は多いですが、研究された被験者の総数は 22 人です。これらの発見を検証するか、ミクログリアの多様性についてさらなる洞察を得るには、より大規模なコホートでの追加研究が必要です。遺伝子発現は細胞のサブタイプを特定するための有用な分子ツールですが、必ずしもタンパク質の発現、局在、機能を直接説明できるわけではありません60。ここで報告されたトランスクリプトームサインに基づいてタンパク質のパネルをアッセイする将来の研究は、検証と病理学的特徴との空間的相関の両方にとって価値があるでしょう。脳領域全体にわたるミクログリア表現型の評価は、表現型の不均一性の理解にさらなる背景を提供することができます。もう 1 つの重大な制限は、解剖脳組織の使用です。死の直前の出来事または死後の変化が、ここで測定される発現変化に寄与している可能性があります。組織の品質の変動を軽減するために、pH が 6.0 を超え、死後間隔 (PMI) が 10 時間未満の組織のみを選択しました。

この研究では、単離されたヒト死後脳核からミクログリアの状態を特定しました。ミクログリアのトランスクリプトームサインの基準を満たす核の中で、この研究ではすべてのクラスターで「老化サイン」が観察され 23 、これは我々の高齢者コホートと一致しています。炎症61は、アルツハイマー病に起因する遺伝子発現プロファイルの解釈を混乱させるだけでなく、アルツハイマー病を引き起こすと仮定される疾患メカニズムにも寄与する可能性があります。若年対照と若年性アルツハイマー病との違いを調査する追加の研究も、老化、炎症、アルツハイマー病特有の特徴を調査するのに役立つ可能性があります。さまざまな代謝および炎症遺伝子発現パターンを持つ複数の内部移行および輸送クラスターの同定は、さらなる研究のためのプラットフォームを提供します。恒常性遺伝子発現が豊富なミクログリアの集団内でアルツハイマー病に特異的なサブクラスターが見つかることは、アルツハイマー病が変化することを示唆しており、したがって、まだ十分に調査されていない細胞内でアルツハイマー病を駆動する分子経路を同定できる可能性がある。アルツハイマー病脳における組成、遺伝子発現、および遺伝子制御におけるクラスター特異的な変化は、神経変性疾患の治療を前進させる上で重要となるミクログリアの生理学的反応のカスタマイズされた標的化をサポートするための追加情報を提供する。

私たちの研究は関連するすべての倫理規制に準拠しており、ワシントン大学の治験審査委員会によって承認されました。人間の脳の背外側前頭前野 (dlPFC) 組織は、書面によるインフォームドコンセントの後、ワシントン大学アルツハイマー病研究センターの神経病理学コアから入手されました。患者（n = 12）は死後、AD 病理を有することが確認された（アルツハイマー病神経障害性変化（ADNC）スコア 2 ～ 3、表 1）。対照個体（n = 10）は、死後神経病理学が低かったか、まったくありませんでした（ADNC スコア 0 ～ 1、表 1）。

脳サンプルは急速冷凍され、-80℃で保存されました。対象の基準には、PMI ≤ 10 時間、併存病理が低いこと（レビー小体および海馬硬化症）、および剖検時の脳 pH ≧ 6 が含まれます。

脳サンプルからの核は、10x Genomics Demonstrated Protocols および De Groot et al.62 を応用したプロトコールを使用して単離されました。簡単に説明すると、生検パンチ (Thermo Fisher Scientific) を使用して、dlPFC 灰白質の 2 mm パンチ 4 つをドライアイス上の 1.5 ml 微量遠心分離管に収集しました。すべての緩衝液、溶液、培地のレシピは補足表 1 ～ 7 に記載されています。核の分離には核溶解バッファーを使用しました。核懸濁液中の核を900μlのパーコール/ミエリン勾配緩衝液62上に層状に置いた。勾配を、ゆっくりと加速し、ブレーキをかけずに、4 °C で 20 分間、950 g で遠心分離しました。ミエリンと上清を吸引し、核ペレットをマイクロリットルあたり 1,000 個の核の濃度で再懸濁バッファーに再懸濁し、すぐに snRNA-seq に進みました。

簡単に説明すると、100 ～ 250 mg の dlPFC 灰白質をドライアイス上の 1.5 ml 微量遠心管に収集しました。脳組織を上記のように均質化した。ホモジネートを穏やかに撹拌しながら4℃で10分間インキュベートし、4℃、500gで7分間ペレット化し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を補充したパーコール/ミエリン勾配緩衝液900μlに再懸濁しました。この懸濁液に、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を補充した核懸濁液300μlを静かに重ねた。勾配を、ゆっくりと加速し、ブレーキをかけずに、4 °C で 20 分間、950 g で遠心分離しました。ミエリンと上清を吸引し、核ペレットを直ちに FANS に送りました。

核を冷FANS培地(10% FBS、10 mM HEPES、100 μM ATA、10% 10× HBSS、0.5% Protector RNase Inhibitor、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤、およびヌクレアーゼフリー水中の1% サポニン)で洗浄し、FANSに再懸濁しました。 1 ミリリットルあたり 2 ～ 2.5 × 106 核の濃度の培地。核を１％ヒトＦｃブロック（クローンＦｃ１．３２１６、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに氷上で１０分間インキュベートした。核を抗 PU.1-PE (クローン 9G7、1:50、Cell Signaling Technology) または IgG-PE アイソタイプコントロール (クローン DA1E、1:50、Cell Signaling Technology) のいずれかで氷上で 4 時間標識し、その後冷FANS培地で3回洗浄し、10μg ml-1 DAPI (Sigma-Aldrich)を添加したFANS培地に再懸濁した。 30,000個のPU.1陽性核が収集されるまで、FACSAria III (BD Biosciences)を使用して核を選別した。選別された核を、4℃、1,000gで10分間遠心分離しました。核ペレットをマイクロリットルあたり 1,000 個の核の濃度で再懸濁バッファーに再懸濁し、すぐに snRNA-seq に進みました。

単核ライブラリーは、メーカーのプロトコールに従って Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM、Library and Gel Bead Kit version 3 (10x Genomics) と 10,000 個の核のターゲット捕捉を使用して生成しました。遺伝子発現ライブラリーは、NovaSeq 6000 プラットフォーム (Illumina) で配列決定されました。

CellRanger 3.0.2 ソフトウェア (10x Genomics) を使用してリードを hg38 ゲノム (GRCh38-1.2.0) にアラインメントすることにより、遺伝子数を取得しました。スプライスされていない核転写物を説明するために、前駆体 mRNA へのリードマッピングが含まれています。私たちの分析のほとんどは R (R Development Core Team 2010) で実行されました。 22 個の PU.1 で分類されたサンプルからの液滴は、Seurat バージョン 3.3 (参考文献 63) を使用して結合されました。同じ 4 人の被験者から分離された未分類の液滴と PU.1 で分類された液滴を、Seurat を使用して結合し、同じ方法で分析しました。 350 個未満の固有の分子識別子、350 個未満の遺伝子、または 1% を超えるミトコンドリア遺伝子を含む液滴は分析から除外されました。 SoupX64 を使用して、残りの液滴から周囲 RNA を除去しました。複数の核を含む液滴は、Scrublet65 を使用してスコア付けされ、除去されました。合計で、核ごとに平均 1,787 個の遺伝子を含む 200,948 個の核が、さらなる分析のためにデータセットに残されました。

核の正規化とクラスタリングは、Seurat バージョン 3.3 (参考文献 63) を使用して実行されました。データは読み取り深度に関して正規化され、ミトコンドリア遺伝子含有量は Seurat の SCTransform66 を使用して回帰除去されました。個々のサンプルのばらつきは、スーラのアンカー機能と統合機能を使用して除去されました63。上位 5,000 個の可変遺伝子が保持されました。 15 個の主成分 (PC) を使用して、k = 20 の共有最近傍グラフを作成しました。モジュラリティ関数は、解像度 0.2 を使用して最適化され、マルチレベル改良を備えたルーヴァンアルゴリズムを使用してクラスターを決定し、幅広いセルタイプを決定しました。各クラスターは DEG を定義する最小閾値 30 を満たしており、コホートの 10% 以上 (2 人以上) の核で構成されていました。

既知の遺伝マーカーのセットを手動で評価することにより、クラスターに細胞タイプの注釈が付けられました 67。ミクログリア核のみを含む新しいスーラオブジェクトが作成されました (n = 127,371)。正規化、個人変動の除去、統合、および共有最近傍グラフの作成を、ミクログリア核に対して上記と同様に繰り返しました。かなりの差異を考慮して 20 台の PC が選択されました。クラスターは、method=igraph およびweights=true を指定した Leiden アルゴリズム 68 を使用して決定されました。クラスターは、Louvain、マルチレベル改良を使用した Louvain、および Leiden アルゴリズムによる分析全体にわたって高度に保存されました。 22 サンプルデータセットと APOE ε3/ε3 対立遺伝子データセットの両方に対する恒常性クラスターサブクラスター化は、以前と同様に正規化、個人差の除去、統合後に行われ、10 台の PC とマルチレベル改良アルゴリズムを備えた Louvain を使用して実行されました。各クラスター内の核の分布は、R の 'chisq.test' 関数を使用して計算され、クラスター内の AD またはコントロールグループのいずれかからの核の実際の割合と、データセットの構成に基づいて寄与すると予想される核の割合とを比較しました。カイ二乗検定の P 値は偽発見率 (FDR) を使用して調整され、調整された P < 0.05 の場合に有意であると見なされます。

クラスターの差次的遺伝子発現解析は、MAST アルゴリズムを使用して実行されました。テストされた遺伝子は、クラスター内の核の少なくとも 25% で発現していました。 DEG は、FDR 調整後の P < 0.05、対数倍率変化 > 1.25 でした。クラスター 1 は不活化されていると注釈が付けられており、ミクログリアの単核研究では「恒常性」と呼ばれることがよくあります。差次的遺伝子発現解析を上記のように繰り返し、他のクラスターをクラスター 1 と比較しました。GSEA は、GO、KEGG、および Reactome 経路セット、バージョン 7.2 を使用して、再現性のためにセットシードを使用するように修正された ClusterProfiler69 で実行されました。濃縮された経路の FDR 調整 P < 0.05 でした。重要な結果に 3 つの主要なデータベース (GO、KEGG、および Reactome) のうちの少なくとも 2 つで類似の遺伝子と生物学的機能が含まれている場合、経路は代表的であるとみなしました。

GSEA を補完するアプローチは、生物学的プロセスオントロジークラスタリングを実行して、遺伝子リストに関連するより広範な用語のセットを特定することです。 ELN クラスター (3、5、および 6) をさらに特徴付けるために、このアプローチを実装して、各クラスターによって駆動される生物学的に関連したプロセスをより詳細に検査しました。この分析を実行するためにいくつかの異なるアプローチを採用し、最終的には、この目的で近年広く使用されている Cytoscape ネットワーククラスタリングアプリケーション ClueGO70,71 を選択しました 72,73,74,75。これにより、単一の GO 用語ヒットを超えて、遺伝的にリンクされたプロセスのネットワークが作成され、基本的な生物学的プロセスが特定の遺伝子セットの差次的発現に基づいて影響を受けているという確信度が高まります。クラスター 3、5、および 6 は、生物学的プロセスの接続を最適化するためにカッパしきい値 0.4 を使用した超幾何検定を使用する片側ポジティブ濃縮アルゴリズムを使用して、それぞれ独立して分析に提出されました。ネットワークに取り込まれた各項は、最初に P < 0.05 の複数のテスト補正閾値でフィルタリングされ、P < 0.01 のベンジャミニ・ホッホベルグ補正値で項に対して階層的に重み付けされました。この手順は検証と視覚化のために実行されるため、視覚化を容易にするために、ランクの低い用語のネットワークをトリミングしました。

軌道分析は、ダウンサンプリングされたデータセットの複数の順列に対して Monocle3 (参考文献 45) を使用して実行されました。データはクラスターあたり 1,000、2,000、3,000、または 5,000 個の核にダウンサンプリングされ、セルデータセットオブジェクトに転送され、Monocle3 'learn_graph' が実行されました。主成分分析と均一多様体近似投影 (UMAP) 埋め込みがスーラオブジェクトから抽出されました。定義された開始点がある場合とない場合の両方でアルゴリズムを適用しました。クラスターあたり 5,000 個の核のダウンサンプリングデータは、一貫した軌道を形成する Monocle の能力を打ち破り始めましたが、1,000、2,000、および 3,000 個の複数の順列では、図 5 の代表的な画像と同様のものが一貫して形成されました (クラスターあたり 3,000 個の核)。。

レギュロンは、Python の SCENIC ワークフロー (pySCENIC) を使用して推論されました 76,77。計算時間を短縮し、すべてのクラスターが比例代表になるように、各クラスター内の 2,000、3,000、または 5,000 個の原子核 (または、クラスター内の原子核の数がこの数より少ない場合は、クラスター内のすべての原子核) をランダムに選択しました。各組み合わせの 5 つのサブセットを作成し、各サブセットに対して分析を 2 回繰り返して、分析におけるレギュロンの一貫性を評価しました。まず、関数「grn」とデフォルト設定を備えた機械学習アルゴリズム GRNBoost2 を使用して、高度に可変性の遺伝子を含む正規化されたカウントを使用して、共発現する制御ネットワークモジュールを生成しました76。次に、「-ctx」機能を使用してモジュールをフィルタリングしました。この機能は、シス調節モチーフ解析 (RcisTarget) を使用して、転写因子の推定標的遺伝子が豊富なモジュールのみを保持します。レギュロンは、単一の転写因子に対して複数のモジュールを組み合わせることによって同定されます。第三に、AUCell 関数を使用して、各核のレギュロン活性を計算しました。レギュロン特異性スコアは、すべてのクラスターの各レギュロンについて計算されました。特異性スコアのランキングにより、データセットの特定のサブセットの特定のクラスターの上位 10 個のレギュロンと、サブセット間の結果の一貫性が特定されました。

コホートの22例のdlPFCから切除した組織をパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した。サンプルは 15 µm で切片化され、免疫染色の前に脱パラフィン処理されました。スライドをクエン酸緩衝液（Sigma-Aldrich、C9999）中で20分間煮沸し、次いでブロッキング緩衝液（10％ロバ血清、0.1％Trition X-100および0.05％Tween 20を含むTBS）に移し、室温で1時間放置した。スライドを一次抗体 (抗 LAMP1 1:100、Invitrogen、14-1079-80; 抗 Iba-1 1:250、Abcam、ab5076; 抗 dsDNA 1:250、Millipore、MAB1293; 抗 PTGDS/ PGD2 1:100、R&D Systems、MAB10099; 抗 P2RX7 1:100、Santa Cruz Biotechnology、sc-514962; 抗 P2RY12 1:50、Alomone、APR-012; および抗 PDE4B 1:50、LSBio、LS- C173292-100) 4 °C で一晩。スライドを TBS-T で 5 分間 3 回洗浄した後、二次抗体 (Thermo Fisher Scientific、Alexa Fluor 488 ロバ抗ヤギ、A11055; Thermo Fisher Scientific、Alexa Fluor 555 ロバ抗マウス、A31570; Alexa Fluor 555 ロバ抗マウス、A31570)ウサギ 555、A31572、Alexa Fluor 647 ロバ抗マウス、A31571、または Alexa Fluor 647 ロバ抗ウサギ、A32795）を室温で 1 時間インキュベートします。次いで、スライドをDAPI (1:1,000、Millipore、D8417)で5分間染色し、続いて5分間のTBS-T洗浄を3回行った。 70% エタノールで 1:20 に希釈した True Black (Thermo Fisher Scientific、NC1125051) をスライドに 50 秒間添加し、続いて TBS でさらに 5 分間洗浄を 2 回行った後、Fluoromount-G (Southern Biotech、0100-01) でマウントしました。）。スライドは、Olympus FluoView-1000 共焦点顕微鏡または×40 および×100 のオイル対物レンズを備えたスピニングディスク共焦点顕微鏡 (横河 W1 スピニングディスクヘッドを備えた Nikon A1R) を使用して画像化され、Z スタック画像の最大投影が生成されました。画像は Fiji を使用して斑点除去されました。

サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されていませんが、サンプルサイズは以前の出版物で報告されているものと同様です22、25、26。データの収集と分析は、実験条件を無視して行われたわけではありません。分析から除外されたデータはありません。 dlPFC からの PU.1 濃縮の主要な snRNA-seq データセットは、全員が 60 歳以上の 22 人のヒト (AD ドナー 12 人と健康な高齢のドナー 10 人) からのものです。サンプルはヒトから採取されたものであり、この研究はアルツハイマー病患者と健康な高齢の脳との間の差異を検出するように設計されていたため、サンプルは条件間でランダム化されなかった。すべての条件が各シーケンスバッチに存在するように、性別と疾患の状態ごとにシーケンスバッチのバランスをとりました。擬似バルク RNA-seq データと snRNA-seq データの統計解析には、それぞれ DESeq2 と MAST を使用しました。 DESeq2 は負の二項分布によって RNA-seq カウントデータをモデル化するように設計されており、MAST は snRNA-seq データで観察されるゼロインフレーションをモデル化するように設計されています。クラスターの割合の統計分析には、正規分布に依存しないカウントデータが使用されました。トラジェクトリ解析とレギュロン検出のためにデータセットがダウンサンプリングされたとき、核はランダムにダウンサンプリングされ、クラスターを均等に表現し、サンプルを元の比率に保つデータセットの複数の反復が生成されました。軌跡解析では、3 つのダウンサンプリング分解能 (クラスターあたり 1,000、2,000、または 3,000 個の核) で 3 つのダウンサンプリングされた順列を合計 9 回の反復で解析し、図 4 に示したものと同様の結果が得られました。pySCENIC レギュロン検出の場合、データセットは次のとおりです。クラスターあたり 1,000 個の核では 5 つの順列、クラスターあたり 2,000 および 3,000 個の核では 3 つの順列でダウンサンプリングされました。これらの各順列は pySCENIC パイプラインを通じて複数回実行され、その結果、27 個のレギュロンが検出されました。これらの 27 例は、図 3 および拡張データ図 6 に表示される一貫性スコアにまとめられました。ヒト組織の免疫組織化学を含む実験は、少なくとも 5 人のヒトからのサンプルで複製され、表示された画像は複数の領域で観察された染色を代表するものです。少なくとも 3 つのヒトサンプル。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

このリソース用に生の形式で生成された匿名データセット全体と、スーラオブジェクトで処理された形式は、Synapse (https://www.synapse.org/#!Synapse:syn51272688) 経由で利用できます。データは、人間のプライバシー規制によって設定された管理された使用条件の下で利用できます。データにアクセスするには、データ使用契約が必要です。この登録は、研究参加者の匿名性を確保するためにのみ行われます。他のすべての研究データは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。このリソースは、公的に入手可能なヒト hg38 ゲノム (GRCh38-1.2.0) も使用しました。

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これらの研究の資金は、RF1AG063540 (SJ および GAG)、P30AG066509 (SJ、KEP、JEY および CDK)、R01AG073918 (SJ および JEY)、および Weill Neurohub (SJ および CDK) によって提供されました。追加の支援はエリソン財団 (SJ) によって提供されました。 KEP は国立老化研究所 5T32-AG052354-02 によってサポートされました。この研究で使用された剖検資料は、アルツハイマー病研究センター (P50AG005136-33) および成人思考変化研究 (U01AG006781) の支援を受けているワシントン大学神経病理学コアから入手したものです。この研究は、ワシントン大学の Hyak スーパーコンピューターシステムによって提供される高度な計算、ストレージ、ネットワークインフラストラクチャの使用によって促進されました。

これらの著者は同様に貢献しました: Katherine E. Prater、Kevin J. Green。

ワシントン大学神経内科、シアトル、ワシントン州、米国

キャサリン・E・プラーター、ケビン・J・グリーン、サイナス・マムデ、アレクサンドラ・コチョイト、キャロル・L・スミス、スーマン・ジャヤデフ

フレッド・ハッチンソンがん研究センター、公衆衛生科学部門、生物統計プログラム、米国ワシントン州シアトル

ウェイ・スン

進化医学センター、アリゾナ州立大学、米国アリゾナ州テンピ

ケネス・L・チオウ & ノア・スナイダー・マックラー

アリゾナ州立大学、進化医学センター、生命科学部、米国アリゾナ州テンピ

ケネス・L・チオウ & ノア・スナイダー・マックラー

Sage Bionetworks, Seattle, WA, USA

ローラ・ヒース、ジェシー・ワイリー、ベンジャミン・ログスドン

米国ワシントン州シアトルのワシントン大学検査医学および病理学部門

シャノン・E・ローズ、C・ダーク・キーン、ジェシカ・E・ヤング

ワシントン大学幹細胞・再生医学研究所（米国ワシントン州シアトル）

ロナルド・Y・クォン、ジェシカ・E・ヤング、スマン・ジャヤデフ

米国ワシントン州シアトルのワシントン大学整形外科およびスポーツ医学科

ロナルド・Y・クォン

ASU-バナー神経変性疾患研究センター、アリゾナ州立大学、米国アリゾナ州テンピ

ノア・スナイダー・マックラー

ワシントン大学医学遺伝学部門（米国ワシントン州シアトル）

エリザベス・E・ブルー & スマン・ジャヤデフ

Brotman Bay Institute for Precision Medicine、米国ワシントン州シアトル

エリザベス・E・ブルー

カハル神経科学、シアトル、ワシントン州、米国

ベンジャミン・ログスドン

ワシントン大学生物統計学部、シアトル、ワシントン州、米国

アリ・ショジャイエ

ノースカロライナ大学神経内科、チャペルヒル、ノースカロライナ州、米国

グウェン・A・ガーデン

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考案および計画された実験: SJ、KJG、KEP、JEY、CLS、BL、および GAG 実験の実施: KJG、CLS、AC、SR、および CDK 分析データ: KEP、KJG、SM、AC、KLC、および JW 生物統計の監視: WS およびAS 論文執筆: KEP、KJG、SJ、SM、AC 論文編集: CLS、WS、AS、JY、EEB、GAG 提供コード: WS、SM、KLC、NS-M.、RYK、LH 研究の概念化とコラボレーション：SJ、GAG、JEY、EEB、BL

スマン・ジャヤデフへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Aging は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

(A) 死後のヒト脳組織の背外側前頭前皮質灰白質から単離された核の蛍光活性化核ソーティングプロットは、後の集団が抽出される DAPI 陽性集団を示します。 (B) PU.1 陽性集団を示すアイソタイプおよび PU.1 染色の例。 (C) 4 つのサンプルからの未分類の snRNAseq データは、複数の脳細胞タイプと、さらに 5 つのクラスターに細分できる小さなミクログリア集団 (n = 1032 細胞) を示しています。 (D) PU.1 濃縮後、同じ 4 人の個体からの snRNAseq データセットにはより多くのミクログリア (n = 23,310 細胞) が含まれており、これらのミクログリアはさらに 9 つのクラスターに区別できます。

ミクログリアマーカー遺伝子、CX3CR1、C1Qb、SPI1 (PU.1)、および APOE はすべて、10 個のミクログリアサブクラスター (左側に 1 ～ 10 の番号が付けられている) で、他の細胞型クラスター (右側に細胞型によってラベル付けされている) よりも高い発現を示しています。。

(A) アストロサイトマーカー遺伝子 GFAP および S100B は、定義された 10 個のミクログリアサブクラスターよりも 2 つのアストロサイト-1 およびアストロサイト-2 サブクラスターで高い発現を示します。ミクログリアクラスター 6 には GFAP の発現がありますが、S100B の発現はありません。 (B) 末梢単球マーカー CCL5 およびデータセットでは発現が低いですが、ミクログリアデータセットには含まれていない CD163+ クラスターで最も高く発現されます。

クラスター 3、5、および 6 で差次的に発現した遺伝子を使用して、Cytoscape アプリケーション ClueGO を使用したネットワークベースの遺伝子オントロジーの濃縮を推進しました。このアプローチでは、超幾何検定を使用する片側ポジティブ濃縮アルゴリズムを使用し、カッパしきい値 0.4 を使用して生物学的プロセスの接続を最適化します。ネットワークに取り込まれた各項は、最初に p < 0.05 の複数のテスト補正閾値でフィルタリングされ、p < 0.01 の Benjamini-Hochberg 補正値で項に対して階層的に重み付けされました。ノードは、遺伝子の数 (円のサイズ) と統計的有意性 (明るい赤色 = Benjamini-Hochberg 補正 p < 0.05、暗茶色 = Benjamini-Hochberg 補正 p < 0.0005) という 2 つの要素に基づいて各ネットワーク内で表されます。 (A) クラスター 3 では、エンドサイトーシス、受容体媒介エンドサイトーシス、脂質結合と脂質合成に関連する 3 つの小さなサブクラスターが同定されました (左端)。 2 番目のサブクラスターはシナプスエンドサイトーシスを中心としています (中間グループ)。そして 3 番目は小胞輸送に関係します (右端)。 (B) クラスター 5 では、オートファジー、受容体媒介オートファジー、およびこれら 2 つの用語の制御にわたる用語のサブクラスターが特定されました (左端)。 2 番目の大きなクラスターでは、エンドサイトーシスと受容体媒介エンドサイトーシス、オートファジー制御に関連するプロセス、および小胞輸送が特定されます。 (C) クラスター 6 では、ELN 空間内で 3 つのサブネットワークが特定され、活発なエンドサイトーシス、リソソームプロセス、およびこれらのコンパートメントとトランスゴルジネットワーク間の移動が示されています (左)。 2 番目の大きな用語のクラスターは、自然免疫機能、活性化、制御、および関連する炎症プロセスに関連することが特定されました (右側)。

(A) APOE ε3/ε3 個人のみの 13 サンプルに対する不偏クラスタリングの UMAP は、9 つのクラスターを示します。 (B) 混合 APOE 遺伝子型データセットで特定されたクラスターと同様に、APOE ε3/ε3 遺伝子型データセットで特定されたクラスターは遺伝子発現によって区別されます。各クラスターの上位 5 つの遺伝子が表示されます。 (C) 混合 APOE および APOE ε3/ε3 コホートからのクラスター間の重複を示すベン図。遺伝子発現プロファイルの有意な重複を示します。

これらは、クラスター 4、7、9、および 10 で遺伝子発現を最も頻繁に駆動した転写因子です。値は、その転写因子が特定のクラスターに固有であったデータセットの順列の反復の割合を示し、濃い色は高い割合を示します。。いくつかの同様の転写因子が複数のクラスターで見られますが、特に最も一般的な転写因子は独特であり、これらのクラスターで生物学的機能を駆動する遺伝子発現を代表するものであることに注意してください。

より大きなデータセットと同様に、データが APOE ε3/ε3 対立遺伝子保有者のみで構成されている場合、クラスター内の遺伝子発現を駆動する転写因子は異なります。

ヒートマップ: (A) エンドリソソーム遺伝子のジーンオントロジー (GO) セットは、クラスター 6 での有意なアップレギュレーションを示します。(B) トール様受容体 (TLR) 遺伝子の京都遺伝子およびゲノム百科事典 (KEGG) セットは、クラスター 6 での有意なアップレギュレーションを示します。クラスター 8 は、遺伝子発現で観察される古典的な炎症表現型を考慮すると予想されるとおりです。 (C) Keren-Shou らの「疾患関連ミクログリア」(DAM) 遺伝子リスト。 2017 年は、ヒトデータセット内の複数のクラスターにわたる遺伝子の上方制御を示しています。これは、アルツハイマー病のマウスモデルを含む研究とは異なり、単一の DAM クラスターを特定していない他のヒト研究を再現しています。

(A) 少なくとも 3 人のヒトにわたる複数のフィールドで観察された染色の代表的な例は、AD 症例 (黒矢印) において、多数のリソソーム (Lamp-1、白) とサイトゾル dsDNA (マゼンタ) の両方を含む活性化されたミクログリアを示しています。 (B) 同じ症例および組織切片におけるサイトゾル dsDNA 免疫反応性のないミクログリア (尖った矢印) (マゼンタ) は、Lamp-1 シグナルが少なく分岐しているように見えます。すべてのスケールバーは 15 ミクロンを表します。

(A) 完全なデータセットからの結果は純粋な APOE ε3/ε3 対立遺伝子コホートで再現されており、「恒常性」クラスター内に複数の部分集団が存在することを示唆しています。これらの部分集団は、1 つの「恒常性のある」部分集団で構成されているにもかかわらず、遺伝子発現によって区別されます。 (B) APOE ε3/ε3 コホートの「恒常性」クラスター 1 内には、全コホートで見られたように AD 脳で有意に増加しているクラスター 1.5 があります (図 6; カイ 2 乗 FDR 補正 p = 6.7673 × 10 −6）。 **= p < 0.01。

補足表 1 ～ 7。

22サンプルの混合APOE遺伝子型データセットの補足データ。これには、他のすべてのクラスターと比較したDEGおよびHMクラスターと比較したDEG、GSEAによって特定された各クラスターの経路、および各クラスター内のADと対照症例を比較した疑似バルク結果が含まれます。

13 サンプルの APOE ε3/ε3 データセットの補足データ。他のすべてのクラスターと比較した DEG、および HM クラスターと比較した DEG、GSEA によって特定された各クラスターの経路、22 サンプルの混合 APOE 遺伝子型データセットクラスターとの DEG の重複のパーセンテージが含まれます。各クラスター内の AD と対照症例を比較した擬似バルク結果。

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転載と許可

Prater、KE、Green、KJ、Mamde、S. 他ヒトのミクログリアは、アルツハイマー病において独特の転写変化を示します。ナット・エイジング（2023）。 https://doi.org/10.1038/s43587-023-00424-y

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受信日: 2022 年 7 月 7 日

受理日: 2023 年 4 月 25 日

公開日: 2023 年 5 月 29 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s43587-023-00424-y

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