雄マウスの腸の代謝風景から、微生物の活動によって決定されるさまざまなニッチが特定される

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メトリクスの詳細

哺乳類の腸の独特のニッチには多様な微生物叢が生息していますが、腸の代謝に対する空間的変動の寄与は依然として不明です。 ここでは、健康な定着した無菌雄マウスの腸に沿った縦方向のメタボロームのマップを示します。 このマップにより、小腸のアミノ酸から大腸の有機酸、ビタミン、ヌクレオチドへの全体的な移行が明らかになります。 私たちは、定着マウスと無菌マウスの代謝状況を比較して、さまざまなニッチにおける多くの代謝産物の起源を解明します。これにより、場合によっては、根底にあるプロセスを推測したり、生産種を特定したりすることができます。 小腸の代謝ニッチに対する食事の既知の影響を超えて、明確な空間パターンは、小腸内のメタボロームに対する特定の微生物の影響を示唆しています。 したがって、我々は腸内代謝のマップを提示し、代謝産物と微生物の関連性を特定します。これは、生物活性化合物の空間的発生を宿主または微生物の代謝に結び付ける基礎を提供します。

哺乳類の腸には多種多様な微生物が生息しており、総称して腸内細菌叢と呼ばれます 1,2。 微生物叢は消化と免疫機能に寄与しており、その破壊は複数の病気に関連しています 3,4。 消化機能と感染症の予防（または原因）に加えて、腸内微生物は宿主や他の微生物に影響を与える生理活性化合物の供給源でもあります3。 小腸と大腸は生理学的に最も異なっており、分類群の保存された組成物が定着しています4,5。 十二指腸は、食事の栄養素、膵胆汁、胃分泌物を受け取ります。 組織透過性、吸収性輸送タンパク質、pH、調節シグナル伝達および免疫応答における地域的な違いにより、小腸内の空腸と回腸のサブ領域がさらに区別されます5。 動物モデルにおける群集プロファイリングでは、さまざまな腸領域における異なる微生物叢の組成が実証されています4、6、7。 これらの縦方向の違いを超えて、管腔内容物と腸粘液の間には、生理機能と微生物叢の組成に関してかなりの違いがあります8。 後者は、特に結腸において、腸内壁上皮細胞を内腔およびその微生物叢から分離する架橋したムチン糖タンパク質からなる高密度のマトリックスです9。 結腸の外側の厚い粘液層は、ムチンの分解に特化した微生物の生息地および栄養源でもあります8,10。 消化管の機能的状況に関する洞察の増加としては、腸粘液に生息して分解するクロストリジウム菌、大腸で特徴的な短鎖脂肪酸やアミノ酸誘導体を生成する特定のファーミクテス菌、さまざまな腸部位で特定のビタミンを生成する細菌などが挙げられます3。 、11、12、13、14、15。

分類学的組成および代謝活動における生物地理学的差異は、糞便サンプルを使用して評価することはできません。なぜなら、糞便サンプルでは説明力が限界内で遠位結腸に限定される可能性があるためです4,16。 これは特に小腸に当てはまります。小腸では、食事の流入、急速な移行時間、消化酵素と抗菌薬の分泌が腸内プロセスを支配し、マイクロバイオームを形成します6、17、18。 因果関係に向けて進むには、さまざまな腸の小領域における細菌集団とその代謝プロセスに関する詳細な情報が、代謝産物の起源を特定するのに役立ちます。 食事成分の大部分は小腸で代謝および吸収され、繊維や生体異物のほか、摂取されたタンパク質や脂質のごく一部が近位結腸微生物叢に利用可能になります17。 したがって、小腸にも存在する微生物由来の生物活性化合物の多くを含め、微生物の活動の多くは糞便サンプルからは明らかではありません 19。 ヒトの小腸における微生物活動の分析には、内視鏡検査の前に手術、非常に広範囲にわたる経口挿管またはパージが必要です。 したがって、腸全体を研究するために動物モデルが使用されます20,21。 最近の例では、定着したマウスの腸の長さに沿った代謝産物濃度が報告され、すべての臓器の化学に影響を与える新しい微生物叢由来の胆汁酸抱合体が発見され、微生物とその宿主への影響との間の因果関係が確立されました7。 さまざまな腸内のニッチに多数の異なる微生物が存在し、その多様な代謝活動を考慮すると、これらの新たに発見された胆汁酸は、解明が待たれている代謝産物に基づく宿主と微生物の相互作用、および微生物と微生物の相互作用の膨大な空間を示す一例にすぎません。

今回我々は、健康な雄の特定病原体フリー（SPF）および無菌マウスの腸に沿った15部位の管腔内容物と粘液における局所的な腸の代謝と群集構成を特徴づけた。 この代謝風景は、小腸と大腸の管腔内容物と粘液の 4 つの主要な腸内生息環境を特徴付けることに加えて、これまで考慮されていなかった小腸内の代謝プロセスを明らかにしました。 さらに、ニッチ特異的な腸内代謝に関する研究の基礎となる微生物由来の代謝産物として、35 の腸内化合物を同定しました。

腸管に沿ったメタボローム組成を体系的にグラフ化するために、5 匹の雄 SPF C57BL/6J マウスの腸全体を 15 の別々の位置でサンプリングし (拡張データ図 1a)、腸粘液から管腔内容物を分離しました。 生物学的変動を最小限に抑えるために、10 ～ 14 週齢のマウスに標準的な実験室食を自由に摂取させ、餌のバルクが盲腸に到達するようにサンプリング前に 4 時間絶食させました 21。 各メタボロームサンプルには、細胞内微生物代謝物だけでなく、食事、マウス、または微生物の活動に由来する細胞外代謝物も含まれており、したがって、高塩濃度での化合物クラスの複雑な混合物でした。 これらの腸関連化合物を定量するために、液体クロマトグラフィー飛行時間型質量分析 (LC-TOF-MS) ワークフローを採​​用しました22。 簡単に言うと、メソッドの実行時間を最適化し、アミノ酸およびヌクレオチド代謝における化合物、糖およびその他の炭素源、胆汁酸および発酵産物を含む、腸内メタボロームの特徴である 138 の代謝産物を定量するための分析標準の組み合わせを確立しました (拡張データ)図1bおよび補足表1)。 これら 138 個の代謝物のうち、128 個は品質管理パラメーター (補足表 1 および補足データ) に基づいて確実に定量化できました。 これらの代謝産物の SPF 腸内腔における平均濃度は、小腸では約 290 nmol mg-1 サンプル、大腸では 1.5 μmol mg-1 サンプルでした。

SPF 管腔内容物と粘液の空間分解分析により、マウス腸の不均一な代謝状況を特徴付けることができました。 15 部位にわたる代謝物プロファイルを内容ごとに階層的にクラスター化し (図 1a)、比較を容易にするために、粘液プロファイルを内容クラスターに従って分類しました (拡張データ図 1c)。 胆汁酸、アミノ酸、およびそれらの誘導体はすべての部位で検出可能でしたが、最大濃度となる 3 つの主な部位 (胃、小腸、大腸) で明確な空間パターンが見られました。 胃の内容物は、主にアミノ酸が高濃度に含まれていることが特徴でした（図1a）。 タンパク質を構成するアミノ酸とその誘導体は、ほぼ独占的に小腸で見つかりました。 大腸クラスターでは、有機酸、ビタミン、ヌクレオチド代謝における化合物が大半を占めていました。 主成分分析（PCA）により、主に第一主成分に沿ったアミノ酸とその誘導体によって小腸と大腸が分離され、2つの領域間の全体的な違いが裏付けられました（図1b）。 大腸内では、第 2 主成分によって管腔内容物のメタボローム プロファイルが粘液からさらに分離されました。 全体として、管腔内容物の代謝産物濃度は、胆汁酸、炭素源、アミノ酸誘導体および有機酸が分離の推進力として粘液中よりも平均して1.7倍高かった（図1cおよび補足表2）。 スペルミジン、クレアチンおよびリンゴ酸のみが管腔サンプルよりも粘液中に有意に豊富でした（P ≤ 0.05、変化倍数 ≥3）。 スペルミジン濃度が高いのはおそらく微生物によるポリアミン生成の結果であり、これは特に大腸において健康な粘液層を維持するのに重要である23（図1cおよび拡張データ図1d）。 ポリアミン濃度の上昇に伴い、ポリアミン前駆体であるアルギニンおよびオルニチンの濃度は、管腔内容物よりも大腸粘液の方が低かった（拡張データ図1dおよび補足表2）。

a、雄のSPFマウスの管腔内容物サンプルからの代謝物存在量の階層的クラスタリング分析。 128 個の定量化された代謝産物すべての存在量は、15 のサンプリング部位にわたって 5 匹のマウスから平均した Z スコア正規化濃度として示されます。 ユークリッド距離に基づくクラスタリングにより、消化管の 3 つの主要な生理学的領域 (胃、小腸、および大腸) に対応する 3 つの主要なクラスターが特定されました。 代謝物は MetaCyc に従って色分けされています (右下)。 b、腸全体をカバーする150個の管腔および粘液サンプルすべてに基づく、個々の雄SPFマウスからの代謝産物濃度のPCA。 PCAは、サンプルあたり5匹のマウスを使用して、Zスコア正規化代謝産物濃度に対して実行されました。 色は腸領域ごとにグループ化された部位を示し、記号は内腔または粘液を示し、大腸内容物クラスターは灰色で強調表示されます。 c、管腔内容物と粘液サンプル間の代謝物濃度の差分分析。 濃度は、それぞれの生息地内の 5 匹の雄マウスの 15 のサンプリング場所すべてで平均されました。 倍率変化が正または負であれば、それぞれ内腔または粘液中の濃度が高いことを示します。 P 値は、複数の検定に対する Benjamini-Hochberg 補正を備えた両側対応サンプル スチューデント t 検定を使用して計算され、-log10 変換されて表示されます。 濃度が大きく異なる代謝物 (絶対 log2(変化倍数) ≥ 1.5、補正 P ≤ 0.05) は、下のボックスで定義されているように、MetaCyc 分類に従って色分けされます。 管腔および粘液のサンプリング タイプは、火山プロットの対応する部分に合わせて左側に概略的に表示されます。 略称：FC、フォールドチェンジ。

ソースデータ

小腸と大腸を区別する特定の代謝産物を同定するために、サンプリング部位および個体全体で、管腔内容物と粘液について個別に、小腸と大腸の平均代謝産物濃度から倍率変化を計算しました。 この鑑別分析により、小腸、特に粘液中の高濃度のアミノ酸および関連代謝産物が明らかになりました（図2a、bおよび補足表3）。 小腸の粘液層がかなり薄いことを考えると、タンパク質構成アミノ酸の濃度が高くなるのは、少なくとも部分的には、サンプリング中の内腔からのキャリーオーバーによって引き起こされる可能性を排除することはできません。 代表的な例はヒスチジンとトリプトファンで、その濃度は小腸全体で一貫して高く、大腸ではすぐに低下しました（図2c）。 大腸は、アミノ酸およびヌクレオチドの代謝における有機酸、ビタミン、化合物の濃度が高いことを特徴としていました（図2a、b）。 全体として、31 の代謝産物は、小腸と比較して細菌負荷が高い大腸の管腔内容物または粘液中で少なくとも 4 倍高い濃度を有しており (補足表 3)、微生物の活性を示しています。 酪酸/イソ酪酸などの短鎖脂肪酸、グリセリン酸などの糖分解産物、および4-ヒドロキシフェニル酢酸などのアミノ酸分解産物の急激​​な増加は、広範な微生物発酵を示しています（図2d）。 PCAは腸粘液内の領域を区別しませんでしたが（図1b）、差分分析により、粘液中のアミノ酸から発酵産物への明確な代謝シフトが明らかになりました（図2a（下）、図2b（右）および図2c） ）、小腸粘液生息地と大腸粘液生息地の間の代謝の違いの証拠を提供します。

a、内腔（上）と粘液（下）における小腸サンプルと大腸サンプルの間の代謝産物濃度の差分分析。 データ点は、5 匹の雄マウスについて、10 個の小腸部位と 4 個の大腸部位の間で計算された平均倍率変化値を表します。 負の値と正の値は、それぞれ小腸または大腸での濃度が高いことを表します。 y 軸は、多重検定のベンジャミニ・ホッホベルグ補正を備えた両側対応標本のスチューデント t 検定を使用して計算された、-log10 変換された P 値を表示します。 濃度が大きく異なる代謝物 (絶対 log2(変化倍数) ≥ 2、補正 P ≤ 0.05) は、ボックス (左下) で定義されているように、MetaCyc 分類に従って色分けされます。 b、図1aの差分分析からの、内腔および粘液における小腸と大腸の間の代謝産物の大幅な変化（絶対log2（変化倍数）≧2、補正P≦0.05）。 P 値は、多重検定の Benjamini-Hochberg 補正を備えた両側対応標本スチューデント t 検定を使用して計算されました。 ドットの色は倍率の変化を示し、ドットのサイズは重要性を示します。 代謝物は、ボックス内で定義されているように、MetaCyc に従って分類されます (左下)。 c、d、それぞれSPF粘液または管腔の15の腸部位にわたるヒスチジンとトリプトファン（c）およびグリセレートと4-ヒドロキシフェニル酢酸（d）の空間プロファイル。 影付きの領域の線は、5 匹の雄マウスからの濃度測定値の平均 ± sem の移動平均を示します。 略語: cec、盲腸; コル、コロン; デュオ、十二指腸; 回腸、回腸。 ジェジ、空腸。 胃、胃。 TMAO、トリメチルアミン N-オキシド。

ソースデータ

全体的なメタボローム パターンでは、小腸または大腸内の個々の部位を区別することはできませんでした。なぜなら、これらの部位での個々のマウス間の差異は、予想どおり 24 であったためです (図 1b)。しかし、代謝産物の約 3 分の 1 は、明確な縦方向の変化を示しました。プロファイル (図 3 および補足表 4)。 小腸における代謝物濃度の階層的クラスタリングにより、十二指腸、空腸、または回腸で最大濃度を有する代謝物という 3 つのグループが生成されました (拡張データ図 2)。 3 つのクラスは管腔サンプルに均等に分布していましたが、ほとんどの粘液濃度は小腸サンプルでは回腸に向かって減少しました (拡張データ図 2b、c)。 十二指腸内容物中の高濃度の代謝産物には、フルクトース（図 3a）やその他の単糖類が含まれており、おそらく遠位小腸に到達する前に宿主によって吸収された残留食物成分である 14,25。 リボフラビン濃度は空腸内容物中で最も高く、微生物の生産または残留食事ビタミンのいずれかに由来します14、15、26。 回腸内容物中の高いアラントイン濃度（図 3a）は、おそらく食糞マウスの小腸上部におけるプリン代謝産物の微生物分解に起因すると考えられます 27。これは、グアニンおよびグアノシンの十二指腸粘液濃度が高いこと（図 3b）およびグアニンの主要な流入と一致しています。固形飼料食を通じてグアノシンを摂取します。 空腸粘液中の高いクレアチン濃度は食事によるクレアチンの結果である可能性がありますが、濃度の低下はおそらくさまざまなクレアチントランスポーターやクレアチン代謝酵素を発現する高エネルギーを必要とする腸細胞による取り込みによるものと考えられます28。 大腸では、階層的クラスタリングにより、最大管腔内容物濃度は主に遠位結腸で明らかになりましたが、粘液のピーク濃度は大腸全体に均一に分布していました（拡張データ図 3）。 管腔内容物では、ウラシル濃度は遠位結腸で最高でしたが、酪酸/イソ酪酸は遠位結腸に向かってわずかに減少するようでした（図3c）。酪酸は結腸細胞の主要なエネルギー源です29。 大腸粘液では、フルクトースの分解生成物であるグリセリン酸 25 が盲腸でピークに達しましたが、結腸では急激に減少しました。 まとめると、我々のデータは、42 種類の小腸代謝物の縦方向の濃度プロファイルに寄与する可能性のある要因として微生物の活動を示唆しています。

a〜c、小腸内容物（a）および粘液（b）、または大腸の管腔内容物または粘液（c）における濃度の異なる代謝産物のプロファイルの例。 影付きの領域の線は、5 匹の雄マウスからの濃度測定値の平均 ± sem の移動平均を示します。 小腸のある領域の代謝産物濃度が隣接する領域と比べて著しく異なる場合は、星印でマークされます (*P ≤ 0.05、**P ≤ 0.01、***P ≤ 0.001)。 十二指腸と空腸におけるフルクトース腸内容物濃度: P = 0.0245; 空腸と回腸におけるリボフラビンの腸内容物濃度: P = 0.0432; 空腸と回腸におけるアラントインの腸内容物濃度: P = 0.0220; 十二指腸と空腸のグアニン粘液濃度: P = 0.0005; 十二指腸と空腸のグアノシン粘液濃度: P = 0.0129; 空腸と回腸のクレアチン粘液濃度: P = 0.0278。 P 値は、両側の対応のあるサンプルのスチューデント t 検定を使用して計算されました。 略語: スト、胃。 デュオ、十二指腸; ジェジ、空腸。 回腸、回腸。 盲腸、盲腸; そしてコル、コロン。

ソースデータ

SPF マウスの腸代謝のこのマップは、複数のサンプリング部位にわたってほぼ一貫したメタボローム パターンを持つ主要ニッチとして小腸と大腸の管腔内容物と粘液を強調しています。 小腸での高濃度のアミノ酸とその誘導体から大腸でのビタミンと発酵産物への一般的な移行は、おそらく大腸での微生物の活動の増加によって引き起こされ、31 の代謝産物の起源が微生物であることを示しています。 さらに、測定された 128 個の代謝産物のうち 42 個について、小腸内の実質的なパターンを定量化しました。 これらの代謝の違いは、少なくとも部分的には腸の異なる領域における微生物の活動に起因する可能性があるため、次に微生物叢の役割を調査しました。

広範な微生物活動で知られる大腸における高い代謝物濃度（図 2a）13、14、29、および小腸における空間代謝物パターン（図 3）は、微生物の起源に関する間接的な証拠のみを提供しました。 これらの代謝産物は微生物由来であるだけでなく、微生物への反応として生成される宿主代謝産物、残留食物成分、または脱落した腸細胞からの細胞内代謝産物である可能性もあります。 腸の代謝に対する微生物の影響についてのより直接的な証拠を入手し、影響を受けた代謝産物の長期的な変化を詳しく調べるために、我々は、雄の無菌 C57BL/6J マウス 5 ​​匹を用いてマッチング実験を実施しました。断食。 一般に、代謝産物の少なくとも 3 分の 2 は細菌の存在下でより高い濃度を示しました。 SPFマウスでは、管腔内容物のほぼ50％と粘液代謝物の30％が、無菌マウスよりも少なくとも2倍高い濃度でした（拡張データ図4aおよび補足表5および6）。 SPF マウスで特に高濃度の代謝物には、胆汁酸、有機酸、芳香族化合物、ビタミンおよびアミノ酸誘導体が含まれます (補足表 5 および 6)。 無菌マウスでは代謝産物の約 4 分の 1 のみがより豊富であり、主に炭素源とヌクレオチドの化合物、および食物起源である可能性があり、SPF マウスの微生物叢によって枯渇しているアミノ酸代謝でした 30。

潜在的な微生物起源の上記の31の代謝産物のうち、24の代謝産物は、無菌マウスと比較してSPFマウスの大腸において少なくとも4倍高い平均濃度を示しました（図4aおよび補足表7）。 短鎖脂肪酸の酪酸/イソ酪酸およびイソ吉草酸/吉草酸、および二次胆汁酸のリトコール酸およびヒオデオキシコール酸は、SPF マウスの大腸内で少なくとも 14 倍高い濃度でした。 このような高濃度は、結腸内の豊富な低酸素および低 pH 耐性バクテロイダルによるよく知られた形成と一致しています 4,31。 ビオチン、インドール-3-プロピオネート、およびグリセロールは SPF マウスのみで検出され、それらの起源が微生物であることを示す強力な証拠が得られました。 インドール-3-プロピオネートは、トリプトファン代謝から生じる腸内微生物叢由来の十分に確立された化合物です13,32。 31 種類の大腸代謝産物のほとんどについて、微生物起源に関する私たちの仮説は、対象を絞った研究、または以前に観察された無菌マウスよりも定着したマウスの方が高いレベルと一致していました 3、19、30、32、33 (図 4a および補足表 7) ）。 遍在する細胞内代謝物 2-オキソグルタル酸の SPF 濃度が高いこと (図 4b) は、前述したように細菌負荷が高いことによって説明される可能性が最も高くなります 34。 新たに同定された微生物由来の代謝物は、ヒドロ桂皮酸、3-ヒドロキシ酪酸、カプロン酸、アデノシン、フコース/ラムノースでした（図4cおよび拡張データ図4b）。 酢酸フェニルや酢酸 4-ヒドロキシフェニルと同様に、ヒドロシンナメートは、いくつかの腸内微生物で in vitro で示されているように、芳香族アミノ酸の発酵から生じる可能性があります 35。 同様に、3-ヒドロキシ酪酸とカプロン酸は発酵生成物です36。 フコース/ラムノースなどの糖は、分泌された微生物のグリコシド加水分解酵素によって食物繊維から遊離される可能性が最も高くなります。 以前の観察と一致して19、30、無菌マウスにおけるクレアチンとグアノシンの大腸濃度が高いことは、宿主または食餌起源を示唆しています（図4a）。 まとめると、無菌マウスよりも SPF マウスの代謝産物濃度が高いことは、大腸内濃度が高い 31 代謝産物のうち 24 種の微生物起源または微生物叢誘導性の宿主産生の裏付けとなる証拠を提供します。

a、小腸よりも大腸の濃度が高い31の代謝物の存在量変化倍数、したがって微生物起源であると仮説が立てられています（差分分析から代謝物を大きく変化させています;図2a、b）。 管腔内容物（左）と粘液（右）の log2 変換後の倍率変化は、5 匹の雄 SPF マウスと 5 匹の雄無菌マウスの 4 つの大腸サンプリング部位の平均濃度から計算されました。 したがって、箱ひげ図は 20 個のデータ ポイントに基づいており、中央値 log2 (倍数変化) は赤で示され、ボックスには 25 から 75 パーセンタイルが含まれ、ひげは外れ値とはみなされない最も極端なデータ ポイントまで伸びています。 灰色の領域は、絶対 log2(倍数変化) ≤ 2 を示します。左側の記号は以前の証拠を示します: () 特定の代謝物に関する一般知識。たとえば、Koh et al. を参照してください。 および de Aguiar Vallim et al.29,66; (Δ) 差のある代謝物の存在量を特定するために、Swiss-Webster 無菌マウスと従来のマウスの比較を使用した Han ら 19 の証拠。 (□) 代謝産物をマウス由来または微生物由来として分類するために、SPF BALB/c マウスからの糞便懸濁液を胃内に接種した無菌および「元無菌」マウスを使用した、まつもとらの証拠 33。 () 代謝産物レベルを比較するために無菌マウスと従来のスイスウェブスターマウスを使用した Marcobal ら 30 の証拠。 () 反応ネットワーク モデルを使用して微生物叢依存性の代謝産物を予測する Sridharan et al.32 の証拠。 説明を含む公開研究から使用されたすべてのデータは、補足表 7 にあります。さらに、(○) は雄の SPF マウスでのみ検出された代謝物を示します。 SPF 専用代謝物の場合、∞ で示されるように、倍率変化は計算できません。 b、c、SPFおよび無菌管腔内容物および粘液中の2-オキソグルタル酸塩（b）およびヒドロ桂皮酸塩（c）の大腸濃度。 実線のバーは、4 つの大腸部位にわたって平均した、5 匹の雄マウスからの測定値の平均濃度を示します。 対応する 20 個のデータ ポイントが円として表示されます。 略語: FC、フォールドチェンジ。 続き、管腔内容物。 GF、無菌。 粘液、粘液。

ソースデータ

代謝産物濃度の上昇に対する食事の寄与を除外するために、我々は非標的フローインジェクション分析飛行時間型質量分析法（FIA-TOF-MS）を使用して固形飼料ペレットの組成を決定しました37。 簡単に言うと、腸サンプルに使用されるプロトコルに従って、3 つの食品ペレットを溶解および抽出しました。 正確な質量と同位体パターンに基づいて、1,379 個の代謝物イオンに推定上の注釈を付けました。 イオン化効率の違いにもかかわらず、測定された強度により、検出された化合物の相対存在量を大まかに推定することができました。 見かけの存在量の分布は著しく偏っていました。 17 の代謝物がペレットに記録された総シグナルの 50% を占め (補足表 9)、二糖類が主な寄与因子 (平均 14%) でした。 他の豊富な代謝産物は、アデニン、リンゴ酸、ヘキソース、リジン、グアノシン、グアニン、トリプトファンでした。 プリンヌクレオチドであるグアノシンとグアニンの食餌濃度が高いことは、無菌マウスにおけるプリンヌクレオチドの豊富さと、プリン分解産物であるアラントインの同時増加が観察されたSPF腸内での濃度の低さを説明します。 最も重要なことは、微生物叢に関連していることが判明した 24 種類の代謝産物のいずれも、食事組成に 0.05% を超えて寄与しなかったことです。 したがって、食事中のこれらのマーカーの豊富さは重要ではないと思われます。

最後に、SPF マウスの小腸における縦方向のパターンを持つ 42 の代謝産物の中で微生物起源の証拠を探しました。 乳酸フェニルを除いて、10 か所すべてのサンプリング部位で平均した場合、SPF マウスでは無菌マウスと比較して 4 倍高い濃度という我々の基準に一致するものはありませんでした (拡張データ図 5a)。 しかし、小腸内の特定の場所では、十二指腸、空腸、回腸を個別に考慮すると、SPFマウスでは8つの管腔内容物と2つの粘液代謝産物が無菌マウスよりも4倍高い濃度に達しました（図5aおよび拡張データ図5b、 c)。 たとえば、プリン代謝の最終生成物であるアラントインの濃度は、SPFマウスの小腸全体で増加し、回腸で最大値に達しましたが、無菌マウスではレベルは低いままでした（図5b）。 一貫して、食事性プリン代謝産物であるグアニン、グアノシン、ヒポキサンチンの濃度は、無菌マウスよりもSPFマウスの方が低く（図5c）、微生物による分解とその後のアラントインへの変換の証拠が得られました。 クレアチンについては異なるプロファイルが見られ、その濃度は当初、SPFマウスと無菌マウスの両方の粘液中で増加しましたが、無菌マウスではベースラインまで低下し、一方、SPFマウスの空腸では最大値に達しました（図5d）。 最初の同時濃度上昇はおそらく食事中のクレアチンの存在によるものであるが、空腸における異なるパターンは腸細胞によるクレアチン消費の微生物産生または微生物による変化を示していた35。 SPF マウスでより高いピーク濃度を示した他の 8 つの代謝産物には、いくつかのアミノ酸またはヌクレオチドの代謝関連化合物が含まれていました。 一例は、芳香族インドール由来のインドールアセチルグリシンで、その濃度はSPF小腸全体で変動しましたが、無菌マウスの遠位小腸では検出限界を下回っていました（拡張データ図5b）。これは微生物の影響を強く示唆しています。 。 シチジン 5-一リン酸、ウラシル、ヒスチジンの小腸濃度が一貫して高いことは、微生物の細胞内代謝産物として最もよく説明されます。 したがって、大腸の 24 の代謝産物に加えて、小腸の 11 の代謝産物の微生物起源の証拠が得られます。

a、雄のSPFマウスでは雄の無菌マウスよりも少なくとも4倍高い濃度の代謝産物のヒートマップ表示、特に小腸の1箇所と小腸全体での濃度。 左側の列は、10 個すべての小腸部位の平均 log2 変換倍率変化 (SPF 対無菌) を示し、次の 3 つの列は、十二指腸、空腸、または回腸の平均倍率変化 (SPF 対 無菌) を個別に示しています。 。 空間プロファイル (図 3 と同様、ここではすべてを示しているわけではありません) から、隣接する領域とは異なる領域 (十二指腸、空腸、または回腸) を特定しました。 アスタリスクでマークされたその領域については、明らかな違いを引き起こしている微生物の関与が疑われ、その結果、無菌濃度よりも高い SPF も生じていると考えられます。 b、SPFおよび無菌管腔内容物中のアラントイン濃度の空間プロファイル。 影付きの領域の線は、5 匹の雄マウスからの濃度測定値の平均 ± sem の移動平均を示します。 c、SPFおよび無菌管腔内容物および粘液中のグアニン、グアノシンおよびヒポキサンチンの小腸濃度。 実線のバーは、10 を超える小腸部位からの 5 匹の雄マウスからの測定値の平均濃度を示します。 50 個の対応するデータ ポイントが円として表示されます。 d、SPFおよび無菌粘液中のクレアチン濃度の空間プロファイル。 影付きの領域の線は、5 匹の雄マウスの濃度測定値の平均値 ± sem の移動平均を示します。 略語: FC、フォールドチェンジ。 GF、無菌。 対、対。 胃、胃。 デュオ、十二指腸; ジェジ、空腸。 回腸、回腸。 盲腸、盲腸; コル、コロン; cont – 管腔内容物。 粘液 – 粘液。 NaN、数値ではありません (倍率変化を計算できませんでした)。

ソースデータ

メタボロームパターンがマイクロバイオーム組成と関連しているかどうかを調査するために、我々は、同じ同腹から飼育された5匹の雄SPFマウスの十二指腸、空腸、回腸、盲腸および結腸の16SリボソームRNA配列決定を使用して、管腔内容物および粘液群集組成をプロファイリングした。 5 つのサイトすべてで、この群集は門レベルではファーミクテス属が優勢であり、科レベルではラクノスピラ科、オシロスピラ科、ラクトバチルス科、バクテロイダ科が優勢でした（拡張データ図 6a）。 予想どおり 7、バクテロイダル属の相対的な存在量は大腸、特に管腔サンプルで増加し、これは短鎖脂肪酸と二次胆汁酸の濃度が高いことと一致していました。 メタボローム パターンと一致して、群集の構成は 3 つの小腸部位にわたってほぼ不変でした。 組成に関する管腔内容物と粘液の主な違いは、一般に多様性が大きいことと、管腔内容物中のアッカーマンシア科の相対的な存在量でした（拡張データ図6a）。 これらの違いは空腸で最も顕著で、そこではコンテンツ コミュニティ全体の最大 20% がアッカーマンシア科でした。

測定された腸内メタボロームに対する微生物の寄与を評価するために、検出された各微生物の酵素プールを予測する PICRUSt2 ツール 38 を使用して、マイクロバイオームの機能的可能性を決定しました。 得られたすべての潜在的な微生物反応のセットを、京都遺伝子ゲノム百科事典 (KEGG) データベースからのマウスの既知の代謝反応のセットと比較することにより、代謝産物は宿主 (7)、マイクロバイオーム (13) に関連している可能性があるものとして分類されました。または両方 (81) (図 6a)。 たとえば、SPF マウスの高濃度のスペルミンとヒドロシンナメートは、それぞれ宿主とマイクロバイオームの起源によって最もよく説明されます。 生産種を特定するために、SPF 腸に沿って空間的に代謝産物と微生物の存在量を相関させました。 全体として、相関係数は正規分布を示し、620 の代謝物と微生物のペアが有意な共起を示しました（P < 0.01）（図 6b）。 潜在的な微生物生産の予測を精緻化するために、無菌マウスよりも SPF マウスに豊富に存在する代謝物 (変化倍数 > 2) のみを考慮しました。 上記の予測された微生物の代謝反応に基づいて、我々はさらに、予測された微生物が、対の代謝産物が関与する反応を触媒する酵素を有するペアに分析を限定した。 合計すると、20の代謝産物と、14の異なる細菌順序を含む91の微生物の存在量との相関関係から、148対の潜在的な微生物代謝産物生成を予測しました（図6cおよび補足表10）。 その遍在性から予想されるように、n-アセチルグルタミン酸やフルクトース分解生成物のグリセリン酸などの代謝中間体は、それぞれ 41 個と 22 個の微生物に関連付けられていました。 10 個の代謝産物は、酪酸塩、ケノデオキシコール酸塩、ラムノースおよびコハク酸塩に対する単一の微生物連鎖を含む、3 つ以下の微生物とより特異的に連鎖していました。 酪酸塩とケノデオキシコール酸塩は、無菌に対する倍率変化が最も高い代謝物であり、既知の短鎖脂肪酸生産者であるラクノスピラ科39の未分類グループと、ラクノスピラ科NK4A136グループのメンバーをそれぞれ原因微生物として特定しました（図） .6d）。 これらおよび他の観察された代謝産物と特定の微生物の空間的共起は、微生物の活動との我々の仮説的な関連性をさらに強化します。

a、微生物代謝機能およびマウス代謝ネットワークのPICRUSt2予測に基づいて、宿主または微生物関連として分類された128個の測定代謝物の重複を示すベン図。 代謝産物の大部分は宿主関連または微生物関連のいずれかに分類できず、7 つの代謝産物は宿主関連、13 の代謝産物は微生物関連です。 27 個の代謝物はどの代謝ネットワークとも一致しませんでした。 b. 126,336 の代謝物と微生物のペアの相関係数の分布。 拡大されたバーは、P 値、SPF の無菌倍率変化、および代謝酵素の存在にしきい値を適用すると、予測される機能的代謝物と微生物のペアの数が 148 にどのように減少するかを示しています。 c、固有の代謝物と微生物の間の関連性を示すサンキー図bで定義された閾値を満たす、正の相関のある代謝物と微生物のペアにおける対応する微生物の順序。 代謝物は MetaCyc に従って色分けされます。 連結線の大きさはペアの数を表します。 d. SPF ルーメンサンプル中の代謝産物濃度と関連微生物の空間プロファイル。 影付きの領域の線は、5 匹の雄マウスでの濃度測定の平均 ± sem、および相対的な微生物存在量の平均 ± sem を示します。 略語: デュオ、十二指腸。 ジェジ、空腸。 回腸、回腸。 cec、盲腸およびcol、結腸。

ソースデータ

我々は、健康な雄のSPFマウスと無菌マウスにおける腸代謝の解剖学的に分解されたマップを報告し、小腸と大腸の管腔内容物と粘液が代謝的に異なる4つのニッチであることを明らかにしました。 小腸のメタボロームはアミノ酸が大半を占め、大腸は発酵生成物、ビタミン、ヌクレオチド代謝における化合物が高濃度に含まれるという特徴があり、これは大腸内の微生物の密度がはるかに高いことと一致しています4。 その物理化学的および免疫学的特性と一致して、腸の内側を覆う高密度の外側粘液層も代謝的に異なり、最も際立った特徴として微生物由来のポリアミンとクレアチンが含まれていました。 クレアチンやスペルミジンなどのポリアミンは、特に微生物叢の存在下で、健康な粘液層を維持する上で重要な役割を果たすことが知られています35、41、42。 タンパク質構成アミノ酸の濃度が非常に高いため、小腸の粘液の薄い層と大腸の厚い層が区別され、これはおそらく管腔内容物からの拡散または酵素媒介タンパク質の分解の結果であると考えられます。

4 つの主要な腸のニッチを特徴付けることに加えて、私たちのデータセットは、小腸内の 42 の代謝物の空間パターンを解決しました。小腸は、本質的にアクセスが困難な腸管の一部であり 18、微生物が多くの生理活性化合物を生産する場所です 19。 胃の下流である十二指腸におけるフルクトースおよび他の単糖類の高濃度は、おそらく、後に宿主によって吸収される食事成分の分解に起因すると考えられます。 小腸の終わりに近づくにつれて、回腸内容物中の高アラントイン濃度につながるプリン代謝産物の微生物による変換の証拠を発見しました。 同様に、SPF マウスの小腸におけるインドールアセチルグリシンなどのインドール誘導体の濃度の高い変動は、微生物起源を示唆しており、これまで主に大腸で報告されてきました 44。 インドールは宿主の消化を制御する腸内ホルモンの放出を調節するため、微生物のインドール代謝は重要です45。 インドール誘導体はまた、上皮バリアの完全性を調節するアリール炭化水素受容体を介してアゴニストとしてシグナルを送り、その結果、腸の炎症を制限します6,46。 したがって、私たちの高解像度メタボロームデータは、小腸のサブ領域内の微生物に関連する代謝動態についての洞察を提供し、それによってTabula Sapiensプロジェクト47やその他の包括的な研究7の転写データなどの確立されたリソースに機能情報を追加します。 我々の代謝変動性は、腸小領域内の異なるサンプリング部位間で報告されているマイクロバイオームの変動と一般に一致していますが、機能的代謝産物データの変動は微生物組成よりもはるかに小さいようであり、これはおそらく腸内マイクロバイオームの機能的冗長性によって説明されると考えられます48。

無菌マウスと比較して SPF マウスの濃度が高いことに基づいて、小腸と大腸でそれぞれ 11 個と 24 個の代謝産物の微生物起源の証拠が得られました。 さらに、マイクロバイオームの代謝潜在力を予測し、空間共起解析を実行することで、20 種類の代謝産物の潜在的な生産者として特定の微生物を特定することができました。 小腸の代謝ニッチは主に食事と宿主の消化活動によって決定されますが 16、我々は腸内微生物叢が脂質や胆汁酸の代謝を超えて小腸メタボロームの形成に寄与していることを示しました 6,49。 私たちの解剖学的に分解された代謝マップにより、微生物によるプリンの分解から生じると思われる回腸のアラントイン濃度の高さなど、代謝物パターンの基礎となるプロセスのいくつかを推測することができ、一般に窒素が制限されている腸内環境に窒素を供給している可能性があります50。 。 SPF マウスの空腸におけるクレアチン濃度の継続的な増加は、無菌マウスにおけるクレアチン濃度の低下と対照的であり、微生物の生産、宿主腸細胞によるクレアチン消費の変化 35,51、または肝臓と腎臓におけるクレアチン生産の刺激のいずれかを示唆しています 28。 大腸における 24 の微生物叢由来の代謝産物には、短鎖脂肪酸の酪酸/イソ酪酸およびイソ吉草酸/吉草酸などのいくつかの確立された微生物産物や、微生物関連の二次胆汁酸であるリトコール酸およびヒオデオキシコール酸が含まれます 31,52,53。 いくつかの研究は、これらの化合物の異なるサブセットが定着マウスの糞便または結腸に非常に豊富に存在することを以前に報告しました3、19、30、32、33。しかし、我々はヒドロシンナメート、アデノシン、3-ヒドロキシ酪酸、カプロン酸およびフコース/ラムノースを新たに同定しました。微生物の代謝起源。 ラムノースとアデノシンは、その形成に必要な酵素を含む特定のクロストリジウム菌や桿菌に結合している可能性があります。 共生する微生物は、他の 3 つの新規化合物の潜在的な生産者ですが、そのような相関関係は、クロスフェドされた代謝産物での微生物の増殖からも間接的に生じる可能性があります。 対照的に、ヒドロシンナメート (3-フェニル-プロピオネートとしても知られる) は、真核細胞では生成できません。 したがって、無菌マウスと比較して SPF マウスの大腸における濃度が 259 倍高いのは、おそらくクロストリジウム菌を介したフェニルアラニンとチロシンの変換によるものと考えられます 13。これは、大腸におけるクロストリジウム菌の存在量が全体の約半分を占めることと一致しています。 SPF マイクロバイオーム 4、13、29。 ケトン体 3-ヒドロキシ酪酸は肝臓で主に生成される宿主代謝産物ですが、16S データで特定されたさまざまなクロストリジウム属の潜在的な生成物でもあります。 したがって、SPFマウスの大腸におけるその10倍高い濃度は、微生物の分泌、宿主による微生物による3-ヒドロキシ酪酸産生の誘導、またはその両方の組み合わせによるものである可能性があり、その解明にはさらなる実験が必要である。

私たちの知る限りでは、マウス腸全体に沿った混乱のない内腔と粘液代謝の最初の解剖学的生体内マップをここに提供します。 これにより、食事介入、疾患モデル、または特定の腸部位を調査した以前の研究の結果も統合されます。 定着した雄のSPFマウスと無菌マウスの代謝状況を比較することで、さまざまなニッチにおける多くの代謝物の起源を解き明かし、場合によっては根底にあるプロセスを推測することができました。 これらの関連性は、特定の代謝産物と微生物の関連性を特定する相関分析を通じてさらに強化されます。 糞便との比較は不足していますが、これらの代謝の違いと報告されている微生物叢の違い7,16に基づいて、単一コロニー形成されたマウスで実証されているように、腸は糞便サンプルのみを使用して近似するにはあまりにも変動しやすい環境であると結論付けています54。 私たちのデータセットは、腸内代謝に関する将来の研究の出発点にもなります。

すべてのマウス実験は、スイス連邦および州の規制に従って実施されました。 カントン・ベルンの動物実験委員会によって許可が与えられました。 雄の C57BL/6J マウスは、スイスのベルン大学のクリーン マウス施設で飼育および維持されました。 C57BL/6J バックグラウンドを持つ雄の定着 SPF マウスを Envigo から購入しました。 雄の無菌 C57BL/6J マウスを帝王切開で入手し、フレキシブル フィルム アイソレーター内で無菌飼育して維持しました。 １グループ当たり５匹の複製動物を使用した。 すべてのマウスは生後 10 ～ 14 週で、病原体が存在しないことが確認され、平均温度 20 °C、湿度 40% の 14 時間明/10 時間暗サイクル下で維持されました。 すべてのマウスには、標準的な実験室用の Kliba Nafag 3436 食餌と水を自由に摂取させました。 4 時間の絶食後の概日リズムによる変動を制御するために、小腸通過の完了を可能にする 55。 残留餌は盲腸にあるため、複製マウスはより比較可能になります。 管腔内容物と腸粘液のサンプルは、以前に記載されているように、腸に沿った 15 か所で収集されました 8。 簡単に説明すると、腹部切開により胃腸管全体が切除されました。 異なる腸領域（胃、小腸、盲腸および結腸）を分離し、縦方向に開き、管腔内容物を除去し、腸壁から粘液をこすり落とした。 サンプルは液体窒素中で急速冷凍されました。

代謝物は、50 mg のサンプルから重量あたり 20 倍量の 80 °C ミリポア水で抽出されました。 サンプルを 10 秒間ボルテックスし、Eppendorf Thermomixer 内で最高速度 (1,500 rpm) で 80 °C で 3 分間インキュベートし、10 秒間ボルテックスし、室温で 20,000 g で 3 分間遠心分離しました。 上清から 150 μl を 96 ウェルマイクロタイタープレートに移し、-80 °C で保存しました。 質量分析の場合、サンプルは、保持時間参照化合物 9-アントラセン カルボン酸 (Sigma-Aldrich) を含む移動相 (メタノール/水/酢酸 49.6:49.6:0.8 v/v/v) で 1:1 に希釈されました。分析まで -20 °C で保存します。 食品ペレットから代謝物を抽出するには、3 つのペレットを秤量し、室温で一晩 20 ml のミリポア水に溶解しました。 翌日、10 ml のミリポア水を加え、10 秒間ボルテックスしました。 1 ミリリットルの食品ペレット懸濁液を 80 °C に加熱し、代謝産物を上記のように抽出しました (エッペンドルフ サーモミキサー内で最高速度 (1,500 rpm) で 80 °C で 3 分間インキュベートし、10 秒間ボルテックスし、3 分間遠心分離しました)。室温で20,000g）。 上清から 150 μl を 96 ウェルマイクロタイタープレートに移し、分析まで -80 °C で保存しました。 測定前に、サンプルを MilliQ 水で 1:20 に希釈しました。

HPLC グレードのメタノールとイソプロパノール、すべての化学薬品、オンライン質量参照用の緩衝添加剤、およびサンプル前処理化学薬品は、Sigma-Aldrich、Agilent Technologies、および Cayman Chemicals から購入しました。 ＬＣ－Ｐａｋ（Ｍｅｒｃｋ）を備えたＩＱ７０００ ＭｉｌｌｉＱ浄水システムを使用して、ＨＰＬＣグレードの水を得た。

サンプルは、デュアル Agilent Jet Stream エレクトロスプレー イオン化 (Agilent Technologies) を使用して、Agilent 6550 精密質量 Q-TOF 質量分析計に接続された Agilent 1290 Infinity LC システムで分析されました。 注入量は 4 μl で、クロマトグラフィー分離は、Zorbax SB-C8 ガードカラムを備えた Zorbax SB-Aq 1.8 μM 2.1 × 50 mm カラムおよび高速分離カートリッジ (2.1 × 30 mm 3.5 μm) を使用して達成されました。 溶出は、2% 移動相 B (メタノール中 0.2% v/v 酢酸) から始まり、13 分かけて 98% 溶離液 B に徐々に変化する、流速 0.6 ml min-1 の直線勾配を使用して達成されました。 続いて、2% 移動相 A (MilliQ 水中 0.2% v/v 酢酸) の定組成流を 1.5 分間行い、2% 溶離液 B で 1 分間平衡化します。 2 GHz 拡張ダイナミック レンジ取得モードで m/z 50 ～ m/z 1,700 の質量範囲にわたるフルスキャン分析を使用するネガティブ モード。 オンライン質量軸補正のために、プリンおよびヘキサキス (1H,1H,3H-テトラフルオロプロポキシ) ホスファジン (HP-0921; Agilent Technologies) を移動相に添加しました。 エレクトロスプレー設定は次のとおりでした: イオン スプレー電圧、3.5 kV ネガティブ モードおよび 4 kV ポジティブ モード。 キャピラリー温度、325 °C; 乾燥ガス流量、10 l min-1。 ネブライザー圧力は 45 psi。

非ターゲットメタボロミクス測定は、Gerstel MPS2 オートサンプラーに接続された Agilent シリーズ 1100 LC ポンプと、デュアル Agilent ジェット ストリーム エレクトロスプレー イオン化 (Agilent Technologies) を使用する Agilent 6550 精密質量 Q-TOF 質量分析計で構成されるセットアップで、FIA-TOF-MS を使用して実行されました。 、マイナスイオン化モードで動作します。 流速は、1 mM フッ化アンモニウムで緩衝化したイソプロパノール/MilliQ 水 (60:40 v/v) からなる移動相 150 μl min-1 でした。 さらに、オンライン質量軸校正化合物として、1 mM の 3-アミノ-1-プロパンスルホン酸および 1 μM のヘキサキス ホスファジン (HP-0921; Agilent Technologies) を移動相に添加しました。 注入量は 5 μl で、測定はランダム化して 2 回注入で実行されました。 質量スペクトルは、4 GHz の高分解能設定を使用して、毎秒 1.4 スペクトルの周波数で 0.48 分間、m/z 50 から m/z 1,700 まで記録されました。 エレクトロスプレー設定は次のとおりでした: イオン スプレー電圧、3.5 kV ネガティブ モード。 キャピラリー温度、325 °C; 乾燥ガス流量、5 l min-1。 ネブライザー圧力は 30 psi。 フラグメンター、スキマー、およびオクトポールの電圧は、それぞれ 175、65、および 750 V に設定されました。

Sigma-Aldrich から入手した 138 種類の精製単一化合物の原液は、MilliQ 水、エタノールと水、メタノールと水の混合物、またはジメチルスルホキシドのいずれかに個別に溶解して調製し、その後 600 µM まで混合しました (すべての標準の完全なリストについては、補足を参照してください)表1）。 混合物を等分し、SpeedVacセットアップ(Christ)内で0.12mbarで完全に乾燥させ、-80℃で保存した。 作業溶液は、0.4% (v/v) 酢酸を含む MilliQ 水で調製し、使用前に濾過しました。

検量線は、MilliQ 水で 7 桁 (17.9 pM ～ 150 μM) にわたる 24 点連続希釈系列から得られ、マトリックス効果を評価するために、プールされた研究サンプル バックグラウンドで得られました。 そのために、希釈したマトリックスに段階希釈した標準混合物を添加しました。 標準物質は、測定の開始時と終了時に正および負のイオン化モードで測定されました。

対数変換されたイオン数と対数変換された濃度の線形回帰は、標準希釈系列からの測定値に対して実行され、濃度の上限から最大 6 つの希釈ステップ、および下限の希釈から 12 のデータ ポイントを反復的に削除できます。 R2値を最大化することが目標です。 定量の下限と直線性の上限は、それぞれ許容される最低および最高の希釈ステップとして決定されました。 次に、得られた傾きと切片に基づいて代謝産物濃度を計算しました。 線形範囲内の値のみがさらなる分析のために考慮されました。 138 の代謝物のうち、128 はこれらの基準に基づいて確実に検出および定量できました。 それぞれの固有の代謝物について、最大 5 つの異なる修飾 (脱プロトン化アニオン、プロトン化カチオン、ナトリウム付加カチオン、二量体カチオン、二量体ナトリウム付加カチオン) を測定し、線形フィット (最も高い R2 値)、線形範囲、および信頼性の高い値に基づいて修飾を手動で選択しました。データセット内のカバレッジ (検出されたサンプルの最大数)。 選択した変更、それぞれの標準の線形適合、および最終的なデータセットは補足表 1 にあります。代謝物濃度は \(\frac{{\mathrm{{nmol}}}}{{\mathrm{{mg }}\;{\mathrm{サンプル}}}}\)。

LC-TOF-MS データについては、MassHunter Quantitative Analysis B.07.00 ソフトウェア (Agilent Technologies) を使用して、前処理、ピークピッキング、およびアノテーションを実行しました。 代謝物は MetaCyc56 (https://metacyc.org/) に従って分類されました。 生データを MATLAB R2021b (MathWorks) にエクスポートした後、バイオインフォマティクスおよび統計ツールボックスに組み込まれた関数を使用して、さらなるデータ分析、統計、および視覚化を実行しました。 グラフ、イラスト、プロットは Illustrator (Adobe) を使用して完成させました。

5 匹の SPF マウスについて、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸の 5 つの部位で粘液と管腔内容物の両方を別々にサンプリングしました。 メーカーの説明書 (QIAamp PowerFecal DNA Kit、Qiagen) に従って DNA 抽出した後、Earth Microbiome プロジェクトのベンチマークとなったプロトコルに従って、縮重プライマー 515FY および 806R を使用して、16S rRNA 遺伝子可変領域 3 および 4 にわたるアンプリコンを調製しました 57,58,59 。 PCR増幅したアンプリコンをゲル精製し(MinElute Gel Extraction Kit、Qiagen)、Illuminaシーケンシングアダプターとバーコードを追加し、続いてビーズベースのクリーンアップを行いました(AMPureビーズ、Beckman Coulter)。 チューリッヒ機能ゲノミクスセンターで Illumina MiSeq を使用してサンプルの配列を決定しました。 72 サンプルからの合計 16,557,915 のシーケンスリード (中央値 = 173,616) は、dada2 v.1.14 (参考文献 60) を使用したアンプリコン配列バリアント (ASV) の推論の入力として機能しました。 プライマー配列 (515FY = GTGYCAGCMGCCGCGGTAA、806R = GGACTACNVGGGTWTCTAAT) は、cutadapt v.2.8 (参考文献 61) を使用して除去され、両方のプライマーを含み、少なくとも 75 塩基長のインサートのみが下流分析用に保持されました。 次に、dada2 R パッケージの filterAndTrim 関数を使用して読み取りの品質をフィルター処理しました (maxEE = 2、truncQ = 3、trimRight = (40, 40))。 learnErrors 関数とdada 関数は、パラメーターとして pool = pseudo を使用してサンプル推論を計算するために使用されました。 読み取りは、mergePairs 関数を使用してマージされ、バイメラは、removeBimeraDenovo 関数 (メソッド = プール) を使用して削除されました。 次に、IDTAXA 分類子 62 と、http://www2.decopher.codes/Downloads.html で入手可能な Silva v.138 データベース 63 を組み合わせて、残りの ASV に分類学的に注釈を付けました。 リード数が 1,000 未満のサンプル (合計 9 サンプル) は、下流分析の対象として考慮されませんでした。 結果として得られた ASV 存在量テーブルは、ビーガン R パッケージの rrarefy 機能を使用して、サンプル間のシーケンス深度の違いを補正するために、共通のシーケンス深度 (サンプルあたり 6,000 リード、つまり、残りの 63 サンプルすべての最小値) までダウンサンプリングされました。 各分類レベルの存在量テーブルは、同じ分類群に属する ASV の存在量を合計することによって計算されました。

統計解析は、バイオインフォマティクスおよび統計ツールボックスに組み込まれた関数を使用して、MATLAB R2021b (MathWorks) で実行されました。 2 つのグループ間 (たとえば、異なるサンプリング サイト間) の値が比較され、ペアサンプル スチューデント t 検定 (MATLAB 統計ツールボックスで実装) を使用して統計的有意性が計算されました。 一般に、5匹の雄マウスが生物学的複製として機能しました。 実験は繰り返されませんでした。 統計的な差異を計算するために使用されるサンプルの正確な数は、各図の凡例に示されています。 誤検出率は、複数の検定 (Benjamini-Hochberg 手順) で計算された P 値を補正することによって制御され、補正された P 値 ≤ 0.05 が統計的に有意であると見なされました。

マイクロバイオーム内の機能豊富さを予測するために、分析された ASV に対して PICRUSt2 v.2.5.1 (参考文献 38) が使用され (補足表 10)、検出された各微生物の酵素分類番号のリストが得られました。 次に、予測されたマイクロバイオーム代謝ネットワークが酵素分類リストから再構築され、bioservices64 python パッケージを使用して KEGG のハツカネズミ代謝ネットワークと比較されました。 測定された代謝産物は、その起源を予測するためにいずれかのネットワークにマッピングされました。 微生物と代謝産物間のすべてのサンプル部位にわたる空間相関は、Scipy v.1.9.3 (ref. 65) Python パッケージを使用して、スピアマン係数として各ペアに対して計算されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

生の LC-TOF-MS データは MassIVE に寄託されており、アクセッション コード MSV000091478 (https://doi.org/10.25345/C5K06XB0Q) で入手できます。 16S rRNA 配列データは、NIH Sequence Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA944604) から BioProject ID PRJNA944604 で入手できます。 KEGG データベースは、代謝物と微生物の関連性のリソースとして使用されました。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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シーケンスデータの処理とメソッド固有の情報の提供を支援してくれた GS Guiral に感謝します。 メタボロミクス ワークフローの設定にご協力いただきました A. Othman 氏と K. Ortmayr 氏に感謝いたします。 米国への国立衛生研究所 RO1 (GM117324)、米国および AJM へのスイス国立科学財団 (SNSF Sinergia CRSII5_177164)、および JT への ETH フェロー プログラム (ETH チューリッヒ財団) による部分的資金提供が認められています。

スイス連邦工科大学チューリッヒ校が提供するオープンアクセス資金。

分子システム生物学研究所、チューリッヒ工科大学、チューリッヒ、スイス

カリン・フー・マイヤー、ジュリアン・トロイヨン、トビアス・フューラー、ニコラ・ザンボーニ、ウーヴェ・ザウアー

ベルン大学病院内臓外科・内科、ベルン大学、ベルン、スイス

ハイ・リー & アンドリュー・J・マクファーソン

チューリッヒ工科大学微生物研究所、チューリッヒ、スイス

メラニー・ラング & 砂川真一

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US と AJM がプロジェクトを構想しました。 KHUM は LC-TOF-MS ワークフローをセットアップし、代謝産物の抽出を含むメタボロミクスおよび 16S シーケンシングのサンプル調製、ゲノム DNA および 16S アンプリコンの調製、メタボロミクス測定、メタボロミクス データ処理、コードの作成を含むメタボロミクスおよびシーケンシング データ分析を実行し、準備および視覚化しました。すべてのメタボロミクスおよびシーケンス データ。 JTは代謝物と微生物の共起解析を実施しました。 HL は、KHUMML 処理された生の配列データの助けを借りてマウス実験を実施し、分析サポートを提供しました。 TF と NZ は、プロジェクトの計画、測定、原稿へのコメントにおいてサポートと指導を提供しました。 SS と AJM は原稿にコメントを提供しました。 KHUMとUSが原稿を書きました。

ウーヴェ・ザウアーへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Metabolism は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 主な取り扱い編集者: Ashley Castellanos-Jankiewicz、Nature Metabolism チームと協力。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a – この研究で使用された 15 のサンプリング部位の概要を示す概略図: 胃の 1 部位、小​​腸の 10 部位 (十二指腸 3 部位、空腸 4 部位、回腸 3 部位)、および大腸の 4 部位 (盲腸、上行結腸、横行結腸、および下行結腸）。 b – この研究で使用した LC-TOF-MS 法で測定した 128 個の代謝物すべての間での MetaCyc 化学クラスの再分割 (補足表 ST1)。 c – 雄の SPF マウスの腸粘液からの代謝産物量の階層的クラスタリング分析。 128 個の定量化された代謝産物すべての存在量は、15 のサンプリング部位にわたる 5 匹のマウスから平均した正規化濃度の Z スコアとして示されます。 クラスタリングは管腔サンプルのユークリッド距離に基づいて実行され（図1a）、その結果、消化管の3つの主要な既知の生理学的領域、すなわち胃、小腸、大腸に対応する3つの主要なクラスターが特定されました。 このヒートマップでは、比較のために、y 軸に沿った代謝物が図 1a の順序に従って並べ替えられています。 3 つの主要なクラスター内の代謝物は、MetaCyc に従って色分けされています (S1b と同様、補足表 ST1)。 d – SPF 管腔内容物および粘液大腸サンプル中のアルギニン、オルニチン、およびスペルミジンの代謝物濃度。 20 個のデータ ポイント (大腸 4 部位、雄マウス 5 ​​匹) がプロットされ、箱ひげ図は代謝産物濃度の中央値を太いマークで示し、25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルは箱で示され、ひげは外れ値とみなされない最も極端なデータ ポイントまで伸びています。

ソースデータ

a、b – 雄の SPF マウスの小腸管腔内容物 (a) および粘液 (b) サンプル 10 個からの代謝物存在量の階層的クラスター分析。 128 の代謝産物の存在量は、5 匹の雄マウスと、それぞれ 3 つの十二指腸、4 つの空腸、または 3 つの回腸サンプルから平均化された正規化濃度の Z スコアとして示されます。 これら 3 つの平均値 (十二指腸、空腸、回腸) に基づいて階層的クラスタリングを実行しました。 大きく変化する代謝物はボックスとアスタリスクでマークされています (p 値 ≤ 0.05)。 P 値は、両側対応サンプル スチューデント t 検定を使用して計算され、補足表 ST4 に記載されています。 ヒートマップのカラーキーは、小腸全体の代謝産物の相対的な存在量が低いか高いかを示します。 c – 3 つの領域に関する、小腸の管腔内容物 (上) と粘液 (下) のピーク濃度の分布。 3 本のバーは十二指腸、空腸、回腸の 3 つの領域を示し、y 軸はそれぞれの領域で発生するピーク代謝物濃度の頻度を示します。 略語：duo – 十二指腸、jej – 空腸、およびile – 回腸。

ソースデータ

a、b – 雄の SPF マウスの 4 つの大腸管腔内容物 (a) および粘液 (b) サンプルからの代謝物存在量の階層的クラスター分析。 128 の代謝産物の存在量は、結腸 (盲腸、上行結腸、横行結腸、および下行結腸) のサンプリング部位ごとに 5 匹の雄マウスから平均した正規化濃度の Z スコアとして示されます。 階層的クラスタリングは、これら 4 つの値に対してのみ実行されました。 大きく変化する代謝物はボックスとアスタリスクでマークされています (p 値 ≤ 0.05)。 P 値は、両側の対応のあるサンプルのスチューデント t 検定を使用して計算されました。 ヒートマップのカラーキーは、大腸全体の代謝産物の相対的な存在量が低いか高いかを示します。 c – 4 つの領域に関する大腸の管腔内容物 (上) と粘液 (下) のピーク濃度の分布が示されています。 4 本のバーは領域を示し、y 軸はそれぞれの領域で発生するピーク代謝物濃度の頻度を示します。 略語: cec – 盲腸、acol – 上行結腸、tcol – 横行結腸、dcol – 下行結腸。

ソースデータ

a – 管腔内容物および粘液サンプルにおける SPF と無菌の比較における代謝物濃度の変化倍数の分布。 5 匹の雄マウスと 15 のサンプリング部位について、それぞれの生息地における代謝産物ごとに倍率変化を計算し、log2 変換し、その分布を x 軸に沿った等高線プロットとして表示します。 周波数は y 軸に示されます。 負の log2 倍数変化は、無菌マウスにおける代謝物濃度が高いことを示し、正の log2 倍数変化は、雄の SPF マウスにおける代謝物濃度が高いことを示します。 灰色で、絶対倍率変化 ≤ 2 がすべてマークされます。 b – SPF および無菌管腔内容物および粘液中のアデノシン、3-ヒドロキシ酪酸、フコース/ラムノース、およびカプロン酸の大腸濃度。 実線のバーは、5 匹の雄マウスからの測定値の平均濃度を示し、大腸の 4 つの部位の平均値を示します。 対応する 20 個のデータ ポイントが円として表示されます。 略語: FC – フォールドチェンジ。 GF – 無菌。 due - 十二指腸、jej - 空腸、および ile - 回腸。 cont – 管腔内容物。 粘液 – 粘液。

ソースデータ

a – 小腸における縦方向パターンを持つ42の代謝産物の平均小腸濃度のLog2変換倍数変化（プロファイル例については図3、図5、補足表ST4を参照）。 管腔内容物（左パネル）と粘液（右パネル）における雄のSPFサンプルと雄の無菌サンプルの間の倍率変化を計算し、10のサンプリング部位と5つの生物学的複製の平均をとりました。 したがって、箱ひげ図は 50 個のデータ ポイントに基づいており、log2 倍率変化の中央値は青で示され、25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルはボックスで示され、ひげは外れ値とみなされない最も極端なデータ ポイントまで伸び、外れ値はプラス記号でマークされます。 。 灰色の領域は、絶対 log2 倍率変化 ≤ 2 を表します。 b – SPF および無菌マウスにおける管腔内容物または粘液濃度の空間代謝産物プロファイル。 影付きの領域の線は、5 匹の雄マウスの濃度測定値の平均 ± sem の移動平均を示します。 略語: FC – フォールドチェンジ。 GF – 無菌。 due – 十二指腸、jej – 空腸、ile – 回腸、cec – 盲腸、col – 結腸。

ソースデータ

十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸の 5 つの部位にわたる男性の SPF 管腔内容物 (上のパネル) と粘液 (下のパネル) の腸全体の群落構成と差異。 家族レベルでの微生物の相対存在量がパーセントで表示されます。 サンプルごとに注釈が付けられたコミュニティ メンバーの上位 95% が個別に表示され、コミュニティの 5% 未満を表す細菌カテゴリは「その他」にグループ化されます。

ソースデータ

補足表 1 ～ 10 は、10 個の個別のタブを持つ 1 つのワークブックに結合されています。 データには、分子に関する詳細情報、特定の倍率変化、P 値、および本文と図を裏付けるその他の情報が含まれます。

サンプルごとに処理および定量化された代謝物データ。

代謝物存在量データ、主成分分析からのスコア (PC1 および PC2)、統計ソース データ (P 値および倍率変化)。

統計ソース データ (P 値および倍率変化)、代謝物濃度データ。

代謝物濃度データ。

統計ソース データ (P 値および倍率変化)、代謝物濃度データ。

統計ソース データ (P 値および倍率変化)、代謝物濃度データ。

KEGG 識別子、統計ソース データ、代謝物濃度データ。

代謝物存在量データ、代謝物濃度データ。

代謝物濃度データ。

代謝物濃度データ。

統計ソースデータ、代謝物濃度データ。

統計ソース データ (p 値および倍率変化)、代謝産物濃度データ。

微生物の存在量データ。

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転載と許可

Meier、KHU、Trouillon、J.、Li、H. 他。 雄マウスの腸の代謝風景から、微生物の活動によって決定されるさまざまなニッチが特定されます。 ナット・メタブ (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42255-023-00802-1

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受信日: 2022 年 6 月 28 日

受理日: 2023 年 4 月 6 日

公開日: 2023 年 5 月 22 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-023-00802-1

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