紅茶とパイナップルの皮と芯から作られたコンブチャ飲料の化学組成と生物学的特性の変化

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7859 (2023) この記事を引用

590 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

得られるコンブチャ飲料の生物学的特性を改善するために、いくつかの原材料がコンブチャの主成分の部分的なサプリメントまたは全体の代替品として使用されています。この研究では、コンブチャ生産のための砂糖の代わりの代替原料として、パイナップル加工の副産物であるパイナップルの皮と芯（PPC）を使用しました。紅茶と PPC をさまざまな比率で融合させてコンブチャを製造し、その化学プロファイルと抗酸化作用や抗菌活性を含む生物学的特性を測定し、PPC を添加していないコントロールのコンブチャと比較しました。その結果、PPCには糖類、ポリフェノール、有機酸、ビタミン、ミネラルなどの有益な物質が大量に含まれていることがわかりました。次世代シーケンスを使用したコンブチャ SCOBY (細菌と酵母の共生培養) 内の微生物群集の解析により、アセトバクターとコマガタエイバクターが最も優勢な酢酸菌であることが明らかになりました。さらに、デッケラとバチルスもコンブチャ SCOBY の中で顕著な酵母と細菌でした。紅茶と紅茶と PPC の融合物を使用して発酵させたコンブチャ製品の比較分析が行われました。その結果、紅茶と PPC の浸出物から作られたコンブチャは、対照のコンブチャよりも高い総フェノール含有量と抗酸化活性を示すことが明らかになりました。紅茶と PPC 浸出液から作られたコンブチャ製品の抗菌特性も、対照のものよりも優れていました。紅茶と PPC をブレンドして作られたコンブチャ製品からは、エステル、カルボン酸、フェノール、アルコール、アルデヒド、ケトンなど、風味、香り、有益な健康特性に寄与するいくつかの揮発性化合物が検出されました。この研究は、PPC が機能性コンブチャ生産のために紅茶と一緒に使用される原料浸出液のサプリメントとして高い可能性を示すことを示しています。

コンブチャは、世界中で消費されている最も人気のある機能性飲料の 1 つです。細菌と酵母の共生培養物（SCOBY）と呼ばれる、細菌と酵母の混合集団を用いて甘茶を微生物発酵させて作られる発酵飲料です1。コンブチャは、ポリフェノール、有機酸、ビタミン、アミノ酸、ミネラル、タンパク質、加水分解物など、原料から遊離するだけでなく発酵中に生成されるさまざまな有益な代謝産物が豊富に含まれているため、その健康上の利点で知られています。酵素1、2、3、4、5。コンブチャ製品に含まれる主な有効成分の含有量は、お茶の種類、発酵条件、コンブチャ SCOBY 内の微生物群集によって異なります。たとえば、緑茶、ウーロン茶、紅茶から調製したコンブチャの総フェノール含有量 (TPC) は、それぞれ 1.248、1.011、0.455 mg 没食子酸/mL コンブチャでした。一方、紅茶コンブチャは、グルコン酸 (70.11 g/L)、酢酸 (11.15 g/L)、D-糖酸 1,4-ラクトン (DSL) (5.23 g/L) などの有機酸含有量が高くなります。 L）、コハク酸（3.05 g/L）、グルクロン酸（1.58 g/L）、アスコルビン酸（0.70 g/L）が緑茶やウーロン茶よりも多く含まれています6。 Jakubczyk らによる研究 7 では、赤茶コンブチャには 242.50 mg/L の総フラボノイド含有量 (TFC) が含まれており、これは緑茶 (181.30 mg/L)、紅茶 (126.70 mg/L)、および白茶よりも高いことが実証されました。お茶 (111.60 mg/L) コンブチャ。文献レビューで示されているように、コンブチャには、抗酸化作用、抗菌作用、抗炎症作用、抗がん作用などの重要な健康上の利点のほか、免疫システムをサポートし、糖尿病、消化器、心血管疾患に関連する健康上の問題を軽減するその他の能力も備わっています5,8。、9、10、11、12、13。ただし、コンブチャ製品の過剰摂取は、特に免疫力の低下した人、多量の飲酒者、妊婦において乳酸アシドーシスを引き起こす可能性があることも懸念すべきです14,15。コンブチャは、低ナトリウム血症、中毒性胆汁うっ滞性肝炎、抗 Jo1 筋炎にも関与しているとされています 16、17、18、19。機能性飲料に対する消費者の需要の高まりにより、コンブチャは最も有望な選択肢の 1 つであると考えられており、2027 年の売上高は 104 億 5,000 万ドルに達すると予測されています14,20。

コンブチャは通常、紅茶 (Camellia sinensis) と砂糖、主にスクロースから製造されます。ただし、緑茶、ウーロン茶、白茶、ルイボス茶、プーアル茶などのさまざまな種類のお茶6、7、12、21、22、および乳糖、ブドウ糖、果糖、ココナッツシュガー、糖蜜などのさまざまな砂糖や甘味料が使用されます。、およびアスパルテーム 23、24、25 も、コンブチャ生産の主成分として評価されており、コンブチャ製品から異なる化学組成、官能特性、生物学的特性、健康効果をもたらします。主成分とは別に、ウィートグラス26、ココナッツウォーター27、バナナの皮とイラクサ28、オークの葉29、グアバの葉30、ヘビまたはサラクなどの代替原材料が従来の成分を部分的または完全に置き換え、生物学的特性と有益な健康効果を高めることが報告されています。果物31、オリーブの葉と蜂蜜32、パイナップル、リンゴ、ザクロのジュース33、パパイヤ34、マルバビスコまたはワックスゼニアオイの花35、ミント36。さらに、コンブチャ SCOBY の代わりに、Trametes versicolor や Lentinula edodes などの他の微生物を使用することも研究されています 37。

さまざまな健康上の利点があるため、生のパイナップルと加工されたパイナップルの消費量は長年にわたって世界的に増加してきました。工業的なパイナップル生産では、皮、芯、葉、茎など、パイナップルの重量の約 50% (w/w) を占める多くのパイナップル副産物が生成されます38。これらの副産物は、高付加価値製品を形成するための安価な原料となります。これまでの研究では、副産物、特にパイナップルの皮と芯（PPC）には、有益な抗酸化物質、抗菌物質、抗菌物質を提供するフェノール化合物、ビタミン、ミネラル、タンパク質分解酵素、糖、粗繊維などの生分解性物質が多く含まれていることが報告されています。 - 炎症による健康への影響39,40,41。このように、PPC は機能性製品の有用成分を増加させるための有望な栄養素材と考えられています。いくつかの研究は、さまざまな栄養成分を含むコンブチャサプリメントの健康増進特性を高める手がかりを提供しています。ただし、昆布茶の貴重な濃縮物として新鮮な PPC を使用するには、さらに適切な文書化が必要です。したがって、この研究は、化学組成を変更し、コンブチャ製品の健康上の利点を促進するために紅茶と組み合わせた PPC サプリメントを評価することを目的としています。

パイナップル (Ananas comosus L. cv. Pattavia) は、ARD 事務所の許可を得て、タイの農業研究開発局 (ARD) 地域 2 から収集されました。乾燥紅茶葉は、タイのチェンマイにあるロイヤルプロジェクトティーハイランドから購入しました。パイナップルも紅茶も野生のものではなく、それぞれノンカイ県とチェンマイ県で栽培されています。サンプルの収集と調製方法は、関連するガイドラインと法律に従いました。

パイナップルの果実を水道の流水で徹底的に洗浄し、汚れや土壌粒子を取り除きました。次に、洗浄したパイナップル果実を剥がしてＰＰＣを回収し、得られたＰＰＣを小片（約０．５×０．５ｃｍ）に切断した。フレッシュカット PPC をブレンダー (HR2225/00、フィリップス、中国) を使用して粉砕し、使用するまで -20 °C で保管しました。加糖紅茶の調製には、乾燥紅茶葉 4.5 g を 1 L の熱湯に 10 分間浸漬しました。４層のチーズクロスで濾過して茶葉を除去した後、６０ｇの黒砂糖（タイ国ミトル・ポル・シュガー・コーポレーション）を加え、砂糖が完全に溶解するまで混合した。得られた甘味のあるお茶をさらなる実験の出発材料として使用しました。生の PPC と乾燥紅茶の化学組成 (総糖 (TS) 含有量、TPC、TFC、抗酸化活性など) を測定しました。

コンブチャスターターカルチャー、またはコンブチャ SCOBY (Chiira Organic、タイ) は、Torán-Pereg らの修正方法を使用して調製されました 42。簡単に言うと、10% (v/v) のコンブチャ SCOBY を、900 mL の甘いお茶を加え、瓶の口を清潔なチーズクロスで覆い、暗所で室温でインキュベートしました。 14 日間のインキュベーション後、得られたコンブチャ SCOBY をその後の実験でコンブチャ生産のスターター培養物として使用しました。

コンブチャ SCOBY の微生物群落を、加糖紅茶での発酵後 3 日以内と 7 日以内に測定しました。コンブチャ SCOBY に含まれる細菌および酵母の全ゲノム DNA (gDNA) は、Kanwal ら 43 によって記載された手順に若干の変更を加えて単離されました。メーカーの指示に従って、BioDrop μLite (Denville Scientific Inc.、ニュージャージー州、米国) を使用して gDNA の純度および濃度を評価し、1% アガロースゲル (Smart Agarose-S) で DNA の品質をモニタリングしました。 BIO、スペイン)。精製された gDNA サンプルは、PCR 増幅、ライブラリーの調製、および配列決定のために、中国北京の Novogene Co., Ltd. に発送されました。保存されたプライマー 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCA-3') および 806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAA-3') を使用して細菌の同定のために細菌 16S rRNA 遺伝子の V3 ～ V4 領域を増幅し、プライマー ITS5-1737F (5'-GGACTACNNGGGTATCTAA-3') を使用しました。 '-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3') および ITS2-2043R (5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3') を使用して、真菌を同定するために内部転写スペーサー (ITS) 領域を増幅しました。 Illumina NovaSeq PE250 プラットフォーム (Novogene Co., Ltd.、北京、中国) を使用してハイスループットシーケンスを実行し、250 bp のペアエンドリードを生成して分析しました。簡単に説明すると、バーコードに接続された特定のプライマーを使用して標的領域を増幅し、2% アガロースゲル電気泳動によって適切なサイズの PCR 産物を選択しました。各サンプルからの正確な量の PCR 産物をプールし、末端修復し、A テール化し、Illumina アダプターでライゲーションしました。定量化およびサイズ分布分析の後、定量化されたライブラリーをプールし、Illumina プラットフォーム上で配列決定して、標準的な Illumina プロトコルに従って 250 bp のペアエンドの生リードを生成しました。バーコードとプライマー配列が切り詰められた後、FLASH (バージョン 1.2.11; http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)44 を使用してペアエンドリードがマージされ、生のタグが取得されました。 FASTP (バージョン 0.20.0) ソフトウェアを使用して生タグの品質フィルタリングを実行し、高品質でクリーンなタグを取得しました。 Vsearch (バージョン 2.15.0) ソフトウェアを使用して、参照データベース (16S/18S の場合は Silva データベース、https://www.arbsilva.de/、ITS の場合は Unite データベース、https://unite. ut.ee/) を使用してキメラ配列を検出します45。キメラ配列を除去した後、Divisive Amplicon Denoising Algorithm 2 (DADA2) または Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME2) ソフトウェア (バージョン QIIME2-202,006) のぼかし除去モジュールを使用して、得られた有効タグのノイズを除去し、存在量が 5 未満の配列を除去しました。 (すべてのサンプル内で n < 5) をフィルタリングして除去し、最終的なアンプリコン配列バリアント (ASV) を取得しました。門、綱、目、科、属、および種の分類学的分類は、操作分類単位 (OTU) アノテーション 46 に基づいて QIIME2 ソフトウェアの Classify-sklearn モジュールを使用して実行されました。

コンブチャ飲料は、Jayabalan et al.1、Kaewkod et al.6、Jakubczyk et al.7 によって記載された手順に若干の変更を加えて、紅茶と PPC の融合から製造されました。簡単に説明すると、4.5 g の乾燥紅茶葉を 1 L の脱イオン熱水に 10 分間浸しました。 4層のチーズクロスで濾過して茶葉を除去した後、得られた熱いお茶をコンブチャ製造の発酵媒体として使用しました。黒糖と PPC の異なる糖分を使用した 7 種類のコンブチャ飲料を製造しました。すなわち、K1: 黒糖 60 g、PPC 0 g。 K2: 黒砂糖 50 g と PPC 10 g; K3: ブラウンシュガー 40 g と PPC 20 g。 K4: 黒糖 30 g および PPC 30 g。 K5: 黒砂糖 20 g と PPC 40 g; K6: 黒糖 10 g と PPC 50 g; Ｋ７：ブラウンシュガー０ｇとＰＰＣ６０ｇ。発酵混合物中の総糖濃度は、コンブチャ生産比較の妥当性を確保するために、PPC から抽出されたパイナップル果汁を使用して 60 g/L に調整されました。コンブチャスターター培養物を発酵混合物に添加して、最終濃度を10％（v/v）とした。発酵瓶の口を 4 層の寒冷紗で注意深く覆い、瓶を室温の暗所に置いて 14 日間発酵させました。発酵中、コンブチャのサンプルが 2 日ごとに採取され、抗酸化作用や抗菌作用などの化学的プロファイルと生物学的特性が分析されました。この研究では、PPC を補給しないコンブチャ K1 を対照治療として使用しました。図 1 にコンブチャ発酵実験のプロセスフロー図を示します。各コンブチャ生産製剤について 3 回の独立した反復を実行し、結果は平均 ± 標準偏差 (SD) として表示されます。

コンブチャ発酵実験のプロセスフロー図。（K1：黒糖60g、PPC0g、K2：黒糖50g、PPC10g、K3：黒糖40g、PPC20g、K4：黒糖30g、PPC30g ＰＰＣの混合物；Ｋ５：２０ｇの黒糖および４０ｇのＰＰＣ；Ｋ６：１０ｇの黒糖および５０ｇのＰＰＣ；およびＫ７：０ｇの黒糖および６０ｇのＰＰＣ）。

コンブチャサンプルの総還元電位または抗酸化活性は、Amanzadeh-Salout et al.47 にいくつかの修正を加えた第二鉄イオン還元力 (FRAP) 法を使用して、Fe3+ を Fe2+ に還元する能力から決定されました。 FRAP試薬は、100 mLの酢酸緩衝液、10 mLの10 mM 2,4,6-トリス(2-ピリジル)-s-トリアジン(TPTZ)溶液、および10 mLの20 mM FeCl3・3H2O溶液を混合することによって調製した。 50 マイクロリットルのコンブチャサンプルを 1.5 mL の FRAP 試薬および 150 μL の蒸留水と混合し、反応混合物を暗所に室温で 10 分間静置しました。インキュベーション後、反応混合物の吸光度を波長593 nmで測定した。 FRAP 抗酸化活性は、参照標準として硫酸第一鉄七水和物を使用して作成された検量線から決定され、コンブチャ 1 リットルあたりのミリモル Fe(II) (mM Fe(II)/L) で表されました。

ラジカル ABTS+ の消去活性は、Mukherjee らによって記載された修正方法に基づいて測定されました 48。ABTS・+ 試薬の調製では、ABTS ストック溶液 (7 mM) を 2.45 mM 過硫酸カリウムと混合し、一晩インキュベートしました。室温では暗い。 ABTS・+原液を734nmにおける吸光度が0.700となるように蒸留水で希釈し、得られた希釈倍率を用いて反応液を調製した。希釈したサンプル溶液 100 マイクロリットルを 3.8 mL の反応溶液と混合しました。暗所、室温で6分間インキュベートした後、反応混合物の吸光度を734 nmの波長で測定した。アスコルビン酸を標準参照として使用し、ABTS+ による阻害のパーセンテージを次の方程式を使用して計算しました: 阻害% = [(Acontrol − Asample)/(Acontrol)] × 100、ここで Acontrol は希釈した ABTS•+ 試薬ですサンプル溶液なし、Aサンプルはサンプル溶液と希釈したABTS・+試薬の反応混合物です。

病原性細菌に対するコンブチャの抗菌活性は、Kaewkod et al.6 が記載したプロトコールに若干の変更を加えた寒天ウェル拡散法でテストされました。この研究で使用したグラム陰性菌 (エロモナスハイドロフィラ、大腸菌 ATCC 25922、緑膿菌 ATCC 27853、チフス菌 DMST 22842) およびグラム陽性菌 (セレウス菌) を含む菌株は、関連学部から提供していただきました。タイ、コンケン大学医学博士。抗菌活性試験では、細菌培養液 200 μl をブレインハートインフュージョン (BHI) ブロス培地に移し、37 °C、150 rpm で 18 ～ 24 時間インキュベートしました。細菌培養物の増殖を600 nmの分光測光法によって測定し、Mueller-Hinton (MH) 寒天 (Himedia TM、インド) 上で拭き取りました。直径６ｍｍのウェルを、滅菌コルク穿孔器を用いて寒天プレート上に調製した。コンブチャサンプルを 10,000 rpm で 5 分間遠心分離して細胞破片を除去し、次に上清を 0.22 μm の滅菌マイクロフィルターで濾過し、寒天ウェルに移しました。プレートを 4 °C で 2 時間保持し、その後 37 °C で 18 ～ 24 時間インキュベートしました。細菌増殖の阻害ゾーンは、Battikh et al.8 の記載に従って決定されました。新鮮なコンブチャの抗菌活性の比較は、酢酸をポジティブコントロールとして、蒸留水をネガティブコントロールとして使用して行われました。対照処理の調製では、8.5 g/L 酢酸を滅菌蒸留水と混合し、pH を 3.0 (コンブチャサンプルと同じ pH) に調整しました。得られた溶液は濾過によって滅菌され、コンブチャサンプルとともに抗菌活性をテストするために使用されました。

糖類（グルコース、フルクトース、スクロースなど）、ビタミン（B1、B2、B3、B6、B9、B12）、有機酸（クエン酸、アスコルビン酸、ギ酸など）を含む PPC の化学組成) は、屈折率 (RI) 検出器 (島津製作所、京都、日本) および Aminex HPX-87H カラム (300 × 7.8 mm) (Bio-Rad、カリフォルニア州ハーキュリーズ) を備えた高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を使用して分析されました。、米国）50℃で。ミネラル含有量 (窒素、リン、カリウム、マグネシウム、マンガン、亜鉛、鉄、銅、カルシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン) は、Central Laboratory (Thailand) Co., Ltd.の原子吸光分光法 (AAS) によって測定されました。タイ、コンケン支店。コンブチャサンプルの pH は電子 pH メーター (FE28 FiveEasy、メトラートレド、スイス) で測定され、総酸度はオシリプンらによって記載された方法を使用して測定されました 33。コンブチャ製品の色はスケール L で測定されました。 *、a*、および b* は、Ultrascan XE SN-U3115 (Hunterlab、米国バージニア州レストン) を使用した標準参照法による。コンブチャ中の TS は、フェノール硫酸法で分析されました 49。TPC は、標準として没食子酸を使用する Folin-Ciocalteu 法 7 によって決定され、結果はコンブチャ飲料 1 リットルあたりのグラム没食子酸当量 (GAE) として表されました。 (g GAE/L)。 TFC は、ケルセチンを標準として使用する塩化アルミニウム比色分析 50 によって測定されました。 TFC は、コンブチャ飲料 1 リットルあたりのケルセチン当量 (QE) のミリグラム数 (mg QE/L) として表されました。コンブチャ中のエタノール濃度は、炎イオン化検出器 (FID) を備えたポリエチレングリコール (PEG-20 M) 充填カラムを使用したガスクロマトグラフィー (GC) (GC-14B、島津製作所、京都、日本) によって測定されました。コンブチャ飲料中の揮発性化合物は、質量分析計 (Agilent 7000B、Agilent Technologies, Inc.、パロアルト、カリフォルニア州、米国) を備えた GC (Agilent 7890A) を使用して測定しました。分析物の分離は、DB ワックスキャピラリーカラム (長さ 60 m、直径 0.25 mm、膜厚 0.25 μm) を使用して評価されました。

コンブチャ発酵実験には完全ランダム化計画 (CRD) が 3 回の反復で使用され、すべてのデータは平均 ± SD として表されました。グループ間の有意差は、SPSS バージョン 28.0 を使用して評価されました。 (IBM SPSS Statistics、ニューヨーク州アーモンク: IBM Corp.) 統計的に有意な水準は、一元配置分散分析 (ANOVA) とそれに続く LSD 事後検定により 0.05 の水準で定義されました (p ≤ 0.05 は有意性を意味します)。

TS、TPC、TFC、抗酸化活性を含む、紅茶と生の PPC の化学組成が評価され、その結果が表 1 にまとめられています。PPC の TS と TPC は、それらよりも約 315 倍と 2 倍高かったです。紅茶の。しかし、紅茶は PPC よりも著しく高い TFC および抗酸化活性を示しました。 FRAP および ABTS アッセイに基づくと、紅茶は強力なフリーラジカル阻害能力 (0.82 mM Fe(II)/L) とラジカル消去能力 (89.94% 阻害) を示し、それぞれ約 1.7 倍と 1.5 倍でした。 PPC。紅茶の高い抗酸化活性は、紅茶のフェノール含量が高く、より重要な抗酸化能力を報告した Zhang らの研究 51 のように、高レベルのポリフェノールとフラボノイドに関連している可能性があります。 TS レベルが低い (0.15 g/L) ため、紅茶は無糖または低カロリーの飲料です。 PPC は紅茶よりも低い pH を示しましたが、これは高い酸性レベル、特にクエン酸やアスコルビン酸と相関している可能性があります。紅茶のｐＨは４．６０であり、茶葉の酸性により紅茶が弱酸性であることを意味する。紅茶に含まれる主な酸の 1 つはタンニン酸 (13.36% を占める) であり、紅茶の風味を決定する際に重要な役割を果たします 52,53。以前の研究では、酸性条件 (pH 7.0 未満) が原料中の有益な化合物の安定性を維持することが実証されました 54。したがって、紅茶と PPC は、コンブチャ製品の強力な抗酸化能力において重要な役割を果たす可能性のあるフェノール化合物とフラボノイド化合物の潜在的な供給源です。

当然のことながら、フェノール類とフラボノイドは主に植物の抗酸化特性に寄与しており、ヒドロキシル基がフリーラジカルに水素原子を供与する能力によりフリーラジカル阻害を強化します55。この研究では、PPC の TPC と TFC はそれぞれ 0.10 g GAE/L と 2.97 mg QE/L を占め、PPC のラジカル阻害能力と消去活性は 0.49 mM Fe(II)/L と 58.97% でした。 39 糖含有量に関しては、グルコースとフルクトースが PPC で検出された重要な糖であり、生体重 (FW) 1 kg あたり 22.93 および 18.87 g を占めました。スクロース含量は 10.80 g/kg FW を占めました (表 2)。これらの発見に基づいて、PPC は、コンブチャ生産に最も一般的に使用される糖の 1 つであるスクロースを部分的または完全に置き換える代替糖源として使用できる可能性があります。

PPC で検出された主な有機酸はクエン酸で、FW 100 g あたり 590 mg を占めていました。 PPC 中のアスコルビン酸またはビタミン C 含有量は 0.02 mg/100 g FW であり、Mohsin らの報告値 40 (47.90 mg/100 mg FW) よりも著しく低かったことに注意する必要があります。この発見は、パイナップル果実の植物種、収穫段階、加工方法の違いに起因している可能性があります。驚くべきことに、PPCには、主に水溶性ビタミン群であるグループBに属するビタミンが多く含まれています（B1、B3、B6、B9の含有量は、それぞれ0.05、0.07、0.01、0.01 mg/100 g FWでした）。。この研究ではビタミンB2とB12は検出されませんでした。 PPC 中に検出されたビタミンはすべて人間の健康に有益であることが知られています。たとえば、B1 はさまざまなカルボキシル化代謝における多くの酵素触媒反応に必須の補因子であり、B3 はさまざまな代謝経路に関与してレベルを低下させる多くの酵素の補因子です。コレステロールを減らし、血行を良くします。 B6 はホモシステインをメチオニンに変換するのに不可欠であり、体内のホモシステインレベルを低下させます。さらに、B9 は、プリンとピリミジン (DNA と RNA に必須) の生合成やアミノ酸の相互変換など、多くの代謝経路における酵素触媒による炭素原子の移動の補因子です 56,57。パイナップルの栄養の場合、いくつかの研究では、B1 (0.05 ～ 0.14 mg/100 g)、B3 (0.13 ～ 0.27 mg/100 g)、B6 (0.08 ～ 0.11 mg/100 g) が最も優勢であることが報告されています。すべてのビタミン58。

糖、有機酸、ビタミンに加えて、PPC にはいくつかのミネラルまたは元素も含まれており、その一部は微生物の増殖と代謝活動に不可欠です。 PPC で検出された主な元素は窒素 (N) で、FW 1410 mg/kg を占め、続いてカリウム (K) (991.95 mg/kg)、マグネシウム (Mg) (77.80 mg/kg)、カルシウム (Ca) (最も低いのは鉄（Fe）（7.60 mg/kg）でした（表 2）。 N とリン (P) はタンパク質と核酸の生合成に必須であり、Fe、Mg、Zn は微生物の成長に必要であり、微生物の生化学反応経路におけるいくつかの酵素の補因子として機能します59。 K はすべての細胞の正常な機能に必要であり、心拍を調節し、筋肉と神経の活動を確保し、タンパク質合成と炭水化物代謝をサポートします。この研究で使用された PPC 中の K と Zn の含有量は著しく高いのに対し、Mg、Ca、マンガン (Mn) の含有量は Lu et al.60 および Romelle et al.60 によって報告されたものよりもかなり低かったことは注目に値します。これは、植物の品種、生育環境条件、収穫段階の違いによるものと考えられます。

コンブチャ SCOBY に含まれる微生物は主に酢酸菌 (AAB) と酵母で、これらはコンブチャ製品の生化学的特性に大きな影響を与えます。微生物の多様性は、SCOBY の供給源、培養培地、発酵条件、およびコンブチャの製造に使用される原材料1,5。図 2 は、次世代シーケンス解析に基づいた 3 日および 7 日のコンブチャ SCOBY の微生物多様性を示しています。 Acetobacter、Komagataeibacter、Bacillus、Bosea、Blautia、Cellvibrio、Faecalibacterium など、いくつかの細菌が同定されました。 3 日間コンブチャ SCOBY で見つかった細菌の中で最も優勢だったのはアセトバクターとコマガタエイバクターで、それぞれ全体の 85.35 % と 6.81% を占めました (図 2A)。これら 2 つの細菌は AAB として分類され、酢酸、グルクロン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、コハク酸などの有機酸の生成を担当します。さらに、それらはセルロースバイオフィルムを形成し、解毒および抗酸化化合物、特にDSL1,11,62が有望であると考えられています。いくつかの研究では、コンブチャ製品中に乳酸菌 (LAB) よりも高いレベルで AAB が検出されたことも指摘されています 63,64。 Lee らによる最近の研究 65 では、いくつかの市販のコンブチャ SCOBY サンプルに含まれる主な AAB は、グルコノバクター (95.25%) とコマガタエイバクター (76.69%) であることが実証されました。コンブチャで検出された主な LAB は主に乳酸菌グループに属し、プロバイオティクスコンブチャ飲料としての生物学的機能を強化します 66,67。しかし、今回の研究ではLABは検出されませんでした。バチルスはコンブチャ SCOBY に含まれるもう 1 つの細菌で、1.07% を占め、乳酸の生成を担っています。バチルス種は、いくつかの食品および飲料製品でプロバイオティクスとしても利用されています。食品発酵では、一部のバチルス属プロバイオティクスが、大豆や食品を発酵させてさまざまな抗酸化物質や抗菌物質を生成する重要な要素として使用されます68。バチルス株と植物の二次代謝産物を組み合わせると、腸系における見かけの生物学的利用能と消化率が向上しました69。 AAB とバチルスに加えて、コンブチャ SCOBY には Blautia sp. などの他の細菌も存在します。およびフェカリバクテリウム属も、発見された数は比較的少ないものの、コンブチャ発酵中に何らかの役割を果たしている可能性があります。文献レビューに基づくと、Blautia sp. およびフェカリバクテリウム属。酢酸、酪酸、短鎖脂肪酸の生産者として知られています。さらに、両方の菌株は、宿主の健康を調節し、メタボリックシンドロームを軽減する役割を果たす可能性のある次世代のプロバイオティクスであると考えられています70,71。

コンブチャの微生物コミュニティ SCOBY。発酵 3 日後 (A) および 7 日後 (B) のコンブチャ SCOBY の細菌の多様性。発酵 3 日 (C) および 7 日 (D) 後のコンブチャ SCOBY の菌類の多様性。

コンブチャ発酵中、微生物群集は、主に 7 日間のコンブチャ SCOBY において、細菌の多様性に顕著な変化を示しました (図 2B)。アセトバクターの割合は 85.35 ％から 82.04 ％にわずかに減少しましたが、コマガタエイバクターとバチルスの割合はそれぞれ 7.35 ％と 1.36 ％に増加しました。これは、細菌の増殖と発生に影響を与えるコンブチャの生化学的変化によるものと考えられます。以前の研究では、Acetobacter がエタノール酸化に関与し、高アルコール環境と強く関連しているのに対し、Komagataeibacter は代謝中にグルコース、フルクトース、スクロース、エタノールを利用することが報告されています 72,73。

酵母はまた、スクロースをグルコースとフルクトースに加水分解し、最終的にはエタノールに加水分解する際にも重要な役割を果たし、コンブチャ製品の風味と香りに影響を与えます。この研究では、Dekkera が 3 日間コンブチャ SCOBY の主な酵母であり、97.94% を占めました (図 2C)。発酵中にコンブチャの pH 値が低下すると、デッケラの増殖が低下しました。これは、7 日間保存したコンブチャ SCOBY からわかります。デッケラの割合は 97.94% から 89.05% に減少しました (図 2D)。デッケラは高レベルのエタノールを生成し、有機酸とエステルの生成に関連しています。これらはコンブチャの香りに影響を与え、アルコール飲料やバイオエタノールの生成に適しています73,74,75。 Tran et al.76 は、Dekkera が比較的高いインベルターゼ活性と高いエタノール含有量の生産における発酵効率を示したと報告しました。

Dekkera sp. に加えて、Chloridium、Archaeorhizomyces、Trichoderma、Rhizospogon、Saitozyma、Suillus などの他のいくつかの酵母も、比較的少量ではありますが検出されました。これらの酵母のほとんどは、植物の表面や根圏に見られる植物関連菌類です。トリコデルマなどの一部の酵素はセルロース分解酵素を生成することが知られていますが、サイトウジマなどの他の酵素はグルコン酸を生成することが知られています77,78。これらの菌類の存在はわずかですが、コンブチャの製造過程では何の役割も果たしていない可能性があります。注目すべきことに、アルコール飲料中のエタノール生産者としてよく知られている一般的なエタノール生成酵母サッカロミセス・セレビシエがこの研究では検出されなかったが、これはコンブチャ SCOBY の供給源と発酵条件の違いに起因する可能性がある。

コンブチャの発酵中、微生物細胞が付着するセルロース層として特定されるバイオフィルムが 3 日以内に確認でき、発酵後 14 日以内に培地の上に浮遊しました。コンブチャ製品の色は、使用する原料の種類や割合によって異なります。表 3 に示すように、紅茶と PPC のブレンドから製造されたコンブチャの L* 値は 88.68 から 90.85 の範囲であり、対照のコンブチャ (74.60) よりも高く、紅茶と PPC のブレンドから製造されたコンブチャ製品が、 PPC はコントロールのコンブチャよりも透明でした。一方、コントロールのコンブチャの a* および b* 値は、紅茶と PPC をブレンドしたコンブチャ製品よりも高く、紅茶と PPC をブレンドしたものよりも赤黄色がかった色を示しています (図 3)。。

「材料と製法」で紹介した黒糖とPPCの糖度の異なる紅茶と紅茶とPPCを融合させたコンブチャ製品の登場です。（K1：黒糖60g、PPC0g、K2：黒糖50g、PPC10g、K3：黒糖40g、PPC20g、K4：黒糖30g、PPC30g ＰＰＣの混合物；Ｋ５：２０ｇの黒糖および４０ｇのＰＰＣ；Ｋ６：１０ｇの黒糖および５０ｇのＰＰＣ；およびＫ７：０ｇの黒糖および６０ｇのＰＰＣ）。

コントロールのコンブチャ (K1) の初期 pH (pH 4.99) は、PPC を添加したコンブチャ (K2 ～ K7) の初期 pH (pH 4.99) よりわずかに高く、範囲は 3.85 ～ 4.46 でした。 PPC の補給量を増やすと、コンブチャの pH 値が低下しました。これは、PPC には特にクエン酸やアスコルビン酸などの有機酸含有量が多く含まれているため、高い酸性度と相関している可能性があります (表 2)。発酵中、コンブチャの pH は 3.85 ～ 4.99 から 2.95 ～ 3.30 に劇的に低下しました。これは食品医薬品局 (FDA) の推奨に基づくコンブチャ飲料の許容範囲内でした5。特に、紅茶と PPC の融合から生成されたコンブチャ (K2 ～ K7) の pH の低下は、対照のコンブチャ (K1) の pH 低下よりも顕著でした (図 4)。発酵期間中の pH の低下は、コンブチャ SCOBY 内の細菌と酵母が糖を酢酸、グルコン酸、グルクロン酸、乳酸、その他の二次代謝産物などのさまざまな有機酸に変換したことを示しています79。さらに、コンブチャの pH が低いと、微生物汚染物質の望ましくない増殖も制限されます4。コンブチャ製品の最終 pH 値は、原材料から放出される、または発酵中に生成されるさまざまな物質と相関している可能性があり、それが微生物の増殖やコンブチャ SCOBY79 の代謝活性に影響を与える可能性があることに注意してください。

「材料と方法」に記載されている、黒糖と PPC の異なる糖分を使用した紅茶と紅茶と PPC の融合物から作られたコンブチャ製品の発酵中の pH 値の変化。

コンブチャ飲料の初期の糖濃度は約 60 g/L でした。コンブチャ SCOBY の微生物の活動により、発酵プロセス中に TS 含有量の変化が観察されました。SCOBY は、糖を炭素源として利用して増殖し、有益な生理活性物質を生成します。使用した原材料の比率にもよりますが、すべてのコンブチャ製品の糖分は、特に発酵の最初の 2 ～ 8 日間で劇的に減少しました。 PPC の割合が高いと、糖の消費率が高くなります。これは、PPC に含まれる主要な糖であるグルコースとフルクトースが他の糖よりも効率的に微生物細胞に取り込まれることに起因すると考えられます。紅茶と PPC のブレンドから製造されたコンブチャ (K2 ～ K7) の最終 TS 濃度は 1.70 ～ 11.13 g/L の範囲であり、対照のコンブチャ (20.45 g/L) (K1) よりも低かった (図 1)。 5)。この発見は、PPC が、貴重な代謝産物の生成をサポートする栄養源として糖を利用するコンブチャ SCOBY の微生物群集の成長と代謝活動を強化することを示唆しました。現在の研究のコンブチャ製品の最終 TS 濃度は、Osiripun ら 33 および Lee ら 65 によって報告されたものよりも低かったことに注意すべきである。これは、初期 TS 含有量、多様性、およびコンブチャ SCOBY の微生物群集の代謝活動、栄養補給レベル、発酵条件。

「材料と方法」に記載されている、紅茶と黒糖と PPC の異なる糖分を使用した紅茶と PPC の融合物から作られたコンブチャ製品の発酵中の総糖量の変化。

コンブチャには、茶葉に由来し、コンブチャ SCOBY 内の微生物群集による発酵中に生成されるポリフェノールが大量に含まれていることが知られています。原材料と比較すると、紅茶と PPC の融合物から作られたコンブチャ製品は、元の紅茶と PPC 材料よりも高いフェノール含有量を示しました。コンブチャ製品のフェノール含有量は、10 ～ 20 g/L PPC を添加したものや PPC を添加しない対照処理と比較して、特に 30 ～ 60 g/L PPC を添加したものでは発酵の終了時に増加する傾向がありました。ウィートグラスジュース 26、黒ニンジン 80、および薬用植物 81 を使用した他の研究で見られるように、紅茶と PPC をブレンドして作られたコンブチャ製品のフェノール含有量の増加は、PPC からのポリフェノールの放出と相関している可能性があります。これまでの研究では、PPC にはさまざまな有益な化合物が含まれており、ポリフェノールもそれらの化合物の 1 つであることが実証されています 61、82、83。

対照昆布茶の最終フェノール含有量は 0.28 g GAE/L でしたが、紅茶と PPC のブレンドから作られた昆布茶のフェノール含有量は 0.27 ～ 0.34 g GAE/L の範囲でした (表 4)。発酵中にフェノール含有量に見られる変動は、コンブチャ SCOBY 内の微生物群集の代謝活動に関連している可能性があります。コンブチャ SCOBY 内の細菌や酵母によって生成されるセルラーゼ、グルカナーゼ、ペクチナーゼ、グルコシダーゼなどの酵素の相乗効果により、原材料中のポリフェノール複合体がより小さなポリフェノールモノマーに分解され、コンブチャ製品のフェノール含有量が増加します。。別の可能性としては、お茶の細胞壁などの植物細胞壁には、コンブチャ製品に放出するのが困難な不溶性の結合フェノールが高レベルで含まれていた可能性があります。コンブチャ発酵中に微生物群集によって生成される酸、アルコール、エステルなどの有益な代謝産物は、フェノール化合物の溶解性に影響を及ぼし、不溶性の結合フェノールの遊離につながる可能性があります67。コンブチャ製品に見られる TPC の低下と同様に、コンブチャ SCOBY 内の微生物群集も加水分解酵素を放出してポリフェノールを他の代謝産物に分解し、それらを代謝活動の栄養源として利用することができ、TPC の低下につながります6,84。 ,85。ポリフェノールの高分子量複合体への重合も、コンブチャ製品中のこれらの化合物の検出を阻害する可能性があります86。したがって、重合した活性化合物の解重合により、測定される総フェノール含有量が増加する可能性があります。

フラボノイドはポリフェノール化合物中に遍在しており、最も豊富で広く普及している植物二次代謝産物の 1 つです。お茶やパイナップルを含む多くの食用植物には、大量のフラボノイドが含まれています61、82、87。紅茶、および紅茶と PPC の融合物から製造されたコンブチャのフラボノイド含有量がこの研究で測定され、結果が表 5 にまとめられています。紅茶コンブチャ (K1) は、融合物から製造されたものよりも高いフラボノイド含有量を示しました。紅茶とPPCの。 PPC 補給率を高めると、特に 40 ～ 60 g/L の PPC を補給したコンブチャの初期フラボノイド含有量が減少しました。初期のフラボノイド含有量は 21.68 ～ 24.05 mg QE/L の範囲でした。 10 g/L (K2)、20 g/L (K3)、および 30 g/L PPC (K4) を添加したコンブチャ製品の発酵中に、フラボノイド含有量の顕著な減少が観察されましたが、他のコンブチャ製品 (K1、K6) 、および K7) は、初期フラボノイド含有量と最終フラボノイド含有量の間にわずかな違いを示しました。発酵中にフラボノイド含有量に見られる変化は、ポリフェノールの酸化反応に起因する可能性があり、これは Gaggìa ら 88 および Jakubczyk ら 7 によっても報告されています。コンブチャ SCOBY 内の微生物群集も可能性があります 89。一例は、LAB、特にLactiplantibacillus plantarumであり、β-グルコシダーゼを放出してポリフェノールとフラボノイドを分解します90,91。さらに、発酵中に起こる抽出物の還元やエステル化反応など、他の要因も関与している可能性があります92。

ここで研究したコンブチャ製品のほとんどには、0.09 ～ 0.99% (v/v) の範囲の低レベルのエタノールが含まれていました。最高のエタノールレベルは K3 コンブチャ製品で検出されましたが、最低は対照のコンブチャ (K1) で検出されました (表 6)。コンブチャに PPC を補給すると、PPC を補給せずに製造した対照コンブチャよりも高いエタノール濃度が得られたことは注目に値します。 PPC を添加したコンブチャのエタノール濃度が高いことは、PPC に含まれる有益な物質と相関している可能性があります。これは、コンブチャには砂糖だけでなくミネラルやビタミンも含まれており (表 2)、体内の微生物群集の成長と代謝活動を促進する可能性があるためです。コンブチャ SCOBY。同様の結果は、リンゴ、ザクロ、赤ブドウ、サワーチェリージュースなどのフルーツジュースを使用して発酵させたコンブチャでも観察され、最終エタノール濃度は 0.82%、0.84%、0.59%、0.67% (v/v) でした。エタノール、それぞれ93．現在の研究と比較して、エタノール含有量の低い値 (0.30 ～ 0.60%)94,95 と高い値 (1.14 ～ 5.83%)7,88,96 も報告されており、これは原材料の違いによるものと考えられます。使用される発酵条件、コンブチャ SCOBY の供給源と微生物組成、およびコンブチャサプリメント材料 97。コンブチャの健康上の利点に関しては、エタノール含有量が 0.05 ～ 1.20% の低アルコール飲料と同様に、低レベルのエタノールは人間の健康に無害な影響を与えます93。

発酵中、コンブチャ SCOBY 内の酵母と細菌は、異なる代謝経路を使用して、複雑な糖を有機酸を含むいくつかの有益な物質に代謝します。コンブチャ製品には、酢酸、乳酸、グルコン酸、グルクロン酸、クエン酸、コハク酸、酪酸5など、コンブチャの香りと風味に影響を与える多くの有機酸が含まれています。この有機酸の蓄積は、コンブチャ製品の総酸性度と pH にさまざまな変化を引き起こします。紅茶と PPC の融合から製造されたコンブチャ製品の総酸度は 15.43 ～ 41.25 g/L の範囲にあり、対照のコンブチャ (6.19 g/L) よりも高いことがわかりました (表 6)。エタノールプロファイルと同様に、PPC を添加したコンブチャ製品における有機酸の蓄積の増加は、コンブチャ SCOBY 内の微生物群集の成長と代謝活性を促進する PPC 内の貴重な物質と相関している可能性があります。以前の研究では、レモンバーム、マンゴスチンの皮、ほうれん草、リンゴ、赤ブドウ、ザクロの果汁などの有益な基質を補充すると、コンブチャ SCOBY が従来のコンブチャと比較して酸含有量がはるかに多くなることが実証されました93,98。特に、コンブチャ製品に蓄積される有機酸は、初期の糖分、コンブチャ SCOBY の微生物組成、発酵条件などのいくつかの要因に依存しました。低い pH の有機酸が過剰に蓄積すると、アシドーシスなど人間の健康に悪影響を与える可能性があります。したがって、コンブチャの発酵条件を最適化する必要があります14,15。

GC-MS 分析に基づくと、コンブチャ発酵後 14 日以内に、12 種類のエステル、6 種類のカルボン酸、5 種類のフェノール、3 種類のアルコール、1 種類のアルデヒド、および 1 種類のケトンを含む合計 28 種類の揮発性化合物が生成されました (表 7)。 de Melo らによる報告99 アミン、炭化水素ラクトン、テルペンなど、私たちの研究では検出されなかった他の揮発性化合物も de Melo らによって報告されました99 さまざまなコンブチャから生じる揮発性化合物の違い製品は、使用される原材料、コンブチャ SCOBY の微生物組成、および発酵条件に関連している可能性があります。対照のコンブチャ (K1) では、19 種類の揮発性化合物 (主にエステル、カルボン酸、アルコール) が検出されました。比較すると、紅茶と PPC をブレンドして作られたコンブチャ製品 (K2 ～ K7) には 19 ～ 23 の化合物が含まれており、そのうち K7 コンブチャ製品には最も多くの揮発性化合物が含まれていました。特に、酢酸エチル、デカン酸エチル、ドデカン酸エチル、酢酸、イソ酪酸、2-メチルヘキサン酸、4-エチル-2-メトキシフェノール、4-エチルフェノール、4-(1,1-ジメチルプロピル)フェノール、エタノールを含む12の化合物、2-メチル-1-ブタノール、フェニルエチルアルコールがすべてのコンブチャ製品から検出されました。ただし、ブタン酸 2-メチル-2-メチルブチル、ベンゼン酢酸エチル、酢酸 2-フェネチル、ヘキサデカン酸エチル、オレイン酸エチル、2-メトキシ-4-プロピルフェノール、4-(2-プロペニル)フェノール、ベンズアルデヒド、およびアセトインは、対照のコンブチャでは検出されませんでしたが、PPC を添加したコンブチャ製品には存在しており、これらの化合物が発酵プロセス中に原料によってコンブチャ製品にもたらされた可能性があることを示唆しています。

エステル含量が高いほど、飲料の品質が優れていることを示します。エステルの中でも、酢酸エチル、デカン酸エチル、ドデカン酸エチルが、すべてのコンブチャ製品で最も多く検出された化合物でした。これらの揮発性化合物は、コンブチャ製品だけでなく、ワイン、蒸留酒、果実蒸留物などの他の多くのアルコール飲料でも一般的に検出されています100、101、102、103、104。短鎖エステルである酢酸エチルは、フルーティーで溶剤のような香りを持つフレーバー化合物です。以前の研究では、リパーゼ触媒による酢酸のエタノールによるエステル化により、主生成物として酢酸エチルが得られることが実証されています105。さらに、さまざまな酵母もアルコールアセチルトランスフェラーゼを介してアシル CoA をエタノールでエステル化し、酢酸エチルを形成します 106。酢酸エチルは、コーヒー果肉から製造される蒸留飲料 103、ピーチスピリッツ 104、パイナップルの副産物から作られる酢 102 など、さまざまな飲料に広く含まれています。カプリン酸エチルとしても知られるデカン酸エチルは、デカン酸またはカプリン酸とエタノールから形成される脂肪酸エステルです。フルーティでフローラルな香りをもたらし、ワイン製造中、特に 15 °C 以上の温度で頻繁に生成されます107。コーヒー果肉からの蒸留飲料やピーチスピリッツなどの他の製品にも、高含有量のデカン酸エチルが含まれています103,104。中鎖エチルエステルであるドデカン酸エチルは、ワインによく含まれる発酵由来のエステルの 1 つです。ワインのアロマに花とフルーティーな香りを与えます108,109。ドデカン酸エチルの形成は、応答する酵素によって引き起こされるアシル-CoA の変換と相関している可能性があります 109。ドデカン酸エチルは、ワインやコンブチャだけでなく、コーヒー果肉やピーチスピリッツから作られた蒸留飲料など、他の飲料にも含まれています103,104。

エチルエステルに加えて、主に酸味のある香りの原因となる 3 つの揮発性酸、酢酸、イソ酪酸、2-メチルヘキサン酸がすべてのコンブチャ製品から検出されました。酢酸は主に揮発性の酸であり、消化、抗酸化レベル、脂質含有量の低下にさまざまな有益な効果をもたらし、血圧を調節します110,111。これはコンブチャ製品に酢のような風味を与えます112。その生成は主に、前駆体としてエタノールを使用するコンブチャ発酵中の AAB に関連しています。他の細菌、例えばＢｌａｕｔｉａｓｐ．およびフェカリバクテリウム sp.70,71、およびデッケラなどのいくつかの酵母属も酢酸生成に関与しています73,74,75。コンブチャ飲料で検出された酢酸の濃度は、使用される原材料と発酵条件に応じて、7.65 ～ 18.00 g/L の範囲で変化しました10。典型的なアルキルカルボン酸であるイソ酪酸は、炎症を介した潰瘍性大腸炎および結腸直腸がんに対抗する予防および治療の両方の可能性を示す短鎖脂肪酸です113,114。花粉で発酵させた kombucha115 を除いて、コンブチャ飲料にはあまり含まれていません。 Clostridium sp.、Faecalibacterium sp.、Lactobacillus sp.116 など、いくつかの細菌がイソ酪酸の生成に関与しています。2-メチルカプロン酸としても知られるメチルヘキサン酸は、独特のプロファイルと優れた組み合わせを持つ中鎖脂肪酸です。チーズ、クリーミー、フルーティーなフレーバー。天然ではリンゴやイチゴに含まれています。私たちの知る限り、2-メチルヘキサン酸はコンブチャ飲料中にはまだ発見されていません。以前の研究では、この揮発性の酸がブラジルの蒸留酒カシャーサや桃の蒸留酒に存在することが実証されています 104,117。注目すべきことに、アルコール飲料の感覚特性に悪影響を与えることが多いオクタン酸、デカン酸、ドデカン酸などの他の揮発性酸も検出されました。これらの酸は、悪臭や脂肪の香りと関連しています103,112。

すべてのコンブチャ製品に含まれる主な揮発性フェノールは、4-エチル-2-メトキシフェノール、4-エチルフェノール、および 4-(1,1-ジメチルプロピル)フェノールでした。これらの揮発性化合物は、ビール、サイダー、ワインなどの他の発酵飲料に広く存在し、その濃度は微生物の組成や発酵条件によって異なります118。揮発性フェノールがコンブチャ飲料の風味の原因となっている可能性があり、それらはヒエ、皮、スモーク、スパイスの風味という独特のプロファイルを示すことが以前に報告されています11,119,120。酵母、特に Dekkera、および Lpb などのいくつかの LAB 種。 plantarum は揮発性フェノールの生成に関与します。これらの微生物は、果物、野菜、穀物に一般的に含まれる不揮発性のヒドロキシ桂皮酸を揮発性のフェノール、特に 4-エチルフェノールと 4-エチルグアイアコールに変換し、コンブチャ飲料の官能特性に影響を与えます 64,112,120。

アルコールもコンブチャの香りと風味に良い影響を与えます。すべてのコンブチャ製品から 3 つの著名なアルコール、エタノール、2-メチル-1-ブタノール、フェニルエチルアルコールが検出されました。これらのアルコールは酵母の代謝による二次生成物と考えられており、アルコール飲料の香りに大きく寄与しています121。酵母は、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンなどの対応するアミノ酸から解糖または異化経路を通じてこれらの化合物を合成できます103。コンブチャ飲料中のフェニルエチルアルコールの存在は、酵母の活性、特に Zygosaccharomyces parabailii の活性と関連していることが報告されています122。これはビールやワインに含まれる一般的なマクロ成分の 1 つであり、花、バラ、ハチミツの香りを示します 123。最近、ハイビスカスを添加したコンブチャから検出されました99。分岐鎖アルコール 2-メチル-1-ブタノールは、酵母におけるフーゼルアルコールの生合成経路であるエールリッヒ経路を通じて生成される代謝産物の 1 つです 124。この麦芽風味の化合物は、レッドラズベリー、ネクタリン、イナゴマメ、黒目エンドウ、ガーデンクレソン、ホースラディッシュの木など、いくつかの植物からも検出されています。私たちの知る限り、コンブチャ飲料にはまだ見つかっていません。しかし、コンブチャ SCOBY には、2-ケト酸を 2-メチル-1-ブタノールに変換する代謝活性を持つ可能性のあるいくつかの酵母種が含まれているため、これは可能である可能性があります124。

揮発性化合物であるベンズアルデヒドとアセトインは、紅茶と PPC をブレンドして作られたコンブチャ製品にのみ含まれています。これらの化合物は、製品の風味を改善するための食品添加物として一般的に使用されています。ベンズアルデヒドは、コンブチャの風味にチェリーとアーモンドのヒントを与え、その形成はグリコシダーゼ酵素を使用する酵母、特に Z. parabailii122 と密接に関連しています。一方、バター、クリーミー、チーズのような匂いを与えるアセトインは、Acetobacter pasturianus などの一部の AAB 種による乳酸の酸化により生成されます 125。一部の LAB 種および枯草菌も、α-アセト乳酸を介してピルビン酸からアセトインを生成します。アセトイン形成に関与する酵素は、α-アセト乳酸シンターゼおよびα-アセト乳酸デカルボキシラーゼです126。この揮発性ケトンは、日本酒、米酢、パイナップル副産物酢に含まれている102,127。

フェノール類、フラボノイド、およびコンブチャ SCOBY 内の微生物群集の代謝活動を通じて発酵中に生成される有機酸、ビタミン、ミネラル、酵素などの有益な代謝物が、コンブチャの抗酸化特性に重要な役割を果たしていることが報告されています。飲み物98,128。さまざまな抗酸化物質は、酸化促進金属への結合、フリーラジカルの除去、酸化促進酵素の阻害など、さまざまなメカニズムを通じてフリーラジカルと反応します129。したがって、抗酸化物質の反応機構に応じて、さまざまな方法が抗酸化物質の評価に使用されてきました130。この研究では、2 つの異なる抗酸化活性プラットフォーム、FRAP および ABTS + ラジカル阻害アッセイを使用して、コンブチャ飲料の抗酸化活性を分析しました。 FRAP アッセイの結果は、発酵培地に PPC を特に高濃度で添加すると、コンブチャの還元力が低下することを示しました。 0日目では、コントロールのコンブチャの還元力は3.87 mM Fe(II)/Lでしたが、PPCを添加したコンブチャの値は、特にコンブチャK3〜K7で3.13〜3.73 mM Fe(II)/Lでした。しかし、発酵中に、すべてのコンブチャ製品で抗酸化活性の顕著な増加が検出され、これらは高い TPC、高い総酸性度、および低い pH と密接に相関していました。発酵中の抗酸化活性の増加は Chakravorty らによっても報告されています 131。特に、発酵の終了時 (14 日間) には、紅茶と PPC から作られたコンブチャ飲料が最も高い還元力を示しました。 4.40 ～ 5.12 mM Fe(II)/L; これらは、対照のコンブチャ（4.39 mM Fe(II)/L）よりも高かった（図6A）。

FRAP (A) および ABTS (B) アッセイを使用した、紅茶および紅茶と PPC の融合物 (「材料と方法」に記載) から作られたコンブチャ製品の抗酸化能力。

さまざまなコンブチャ製品が、ABTS ラジカルを除去する抗酸化物質としてテストされ、結果が図 6B にまとめられています。 FRAP アッセイで示されるように、紅茶 (K2、K3、K4、K5、K6、および K7) に PPC を添加すると、得られるコンブチャの抗酸化活性が低下しました。コントロールのコンブチャ (0 日目) によって除去された ABTS + ラジカルの割合は 97.68% でしたが、紅茶と PPC をブレンドして作られたコンブチャの値は 90.78 ～ 94.57% でした。特に、紅茶と PPC から作られたコンブチャは、発酵プロセス中にラジカル消去効率の大幅な増加を示し、97.80 ～ 98.80% の範囲内の最大値に達しましたが、対照のコンブチャの値は発酵中に変化しませんでした。これらの結果は、リンゴ、ザクロ、パイナップルジュース 33,132、サワーソップ 133、オリーブの葉と蜂蜜 134、スネークフルーツ 31,135 などのフルーツジュースに関する以前の研究と一致して、PPC がコンブチャ飲料の抗酸化活性を強化することを実証しました。 PPC には、ポリフェノール、ミネラル、ビタミンなどのいくつかの潜在的な抗酸化物質のほか、コンブチャ SCOBY 内の微生物群集の成長と代謝活動を促進する他の有益な物質が含まれているため、これらの化合物と発酵中に生成される微生物の代謝産物も含まれています。有機酸と揮発性化合物は、コンブチャ製品の全体的な抗酸化活性に寄与している可能性があります。

コンブチャは、細菌、酵母、真菌などのさまざまな病原性微生物に対して抗菌効果があります10,20,136。ポリフェノール、有機酸（特に酢酸）、アルコール、その他の揮発性化合物など、原材料から放出されるか、発酵中に微生物群集の代謝活動を通じて生成されるいくつかの有益な物質は、コンブチャの抗菌特性に起因すると考えられています5,6。、8。異なる成分は、微生物の増殖を防止または阻害するための異なるメカニズムを示します。例えば、有機酸は、細胞質を酸性化し、細胞内 pH 79,98 を低下させることにより、病原性細菌や芽胞形成細菌に影響を与えます。ポリフェノールは 2 つの方法で作用します。ポリフェノールは活性型に修飾されて有益な細菌を増強することも、組成を変化させて病原性細菌を阻害することもできます 137。この研究では、発酵紅茶と PPC から抽出したコンブチャが、グラム陰性菌 (A. ハイドロフィラ、大腸菌 ATCC 25922、緑膿菌 ATCC 27853、および腸チフス菌) やグラム陰性菌を含む、試験したすべての病原体に対して強力な抗菌活性を示しました。酢酸を使用した対照処理と同様の陽性細菌 (B. セレウス)。現在の研究のこれらの結果は、レモンバームを添加したコンブチャ茶が緑膿菌 ATCC 27853、プロテウスミラビリス ATCC などのグラム陰性菌に対して優れた抗菌活性を示すことを実証した Cetajevic-Simin ら 138 の報告結果と一致しています。 35659、E. coli ATCC 25922、S. enteritidis ATCC 13076、Erwinia carotovora NCPPB 595、および黄色ブドウ球菌 ATCC 25923、B. cereus ATCC 10876、Sarcina lutea ATCC 9341 などのグラム陽性菌。おそらく、対照製品中の酢酸レベルが低かったため、試験したいずれの病原体に対しても対照コンブチャから検出されました。別の可能性としては、紅茶と PPC から作られたコンブチャ製品には、対照には存在しないいくつかの揮発性有機化合物が含まれていたということです。これらの揮発性有機化合物は細菌細胞と相互作用し、膜損傷、代謝異常、細胞破壊を引き起こし、さまざまな微生物の増殖を阻害した可能性があります139,140。さらに、これまでの多くの報告では、原料から放出されるフェノール化合物とフラボノイド化合物が細菌の増殖を制限することが実証されています 141,142,143。したがって、コンブチャ飲料の抗菌活性は、有機酸と、ポリフェノールや揮発性有機化合物などの他の生物活性成分の存在によるものです。したがって、紅茶と PPC は、コンブチャの抗菌活性を高めるのに効果的な組み合わせであると考えられます。

発酵に使用される砂糖の一部または全部を代替原料としてPPCを使用して作られた紅茶コンブチャは、今回の研究で初めて製造されました。化学組成分析に基づくと、PPC には糖、有機酸、ビタミン、ミネラル、ポリフェノールなど、微生物の増殖、代謝活動、コンブチャ製品の生物学的特性を促進する可能性のあるいくつかの有益な物質が含まれています。 PPC を補給すると、グラム陰性菌やグラム陽性菌に対するコンブチャ飲料の TPC、抗酸化作用、抗菌作用が強化されました。紅茶と PPC から作られたコンブチャ製品からは、エステル、カルボン酸、フェノール、アルコール、アルデヒド、ケトンなど、風味、香り、健康への有益な効果に寄与するいくつかの揮発性化合物が検出されました。これらの発見は、PPC が機能性コンブチャ飲料を製造する際のサプリメントとして使用する十分な可能性を持っていることを明確に示しました。コンブチャの多くの健康上の利点は、主にいくつかのヒト細胞株を使用したインビトロおよびインビボアッセイを使用して決定されるため、ヒト被験者におけるコンブチャの健康上の利点の経験的証拠に関する報告はありません。したがって、さらなる研究、特に臨床試験に取り組む必要があります。

記事を投稿するということは、記載されている作品がいかなる形式でもこれまでに出版されていないことを意味します。

現在の研究中に生成された DNA 配列データセットは、NCBI リポジトリ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) でアクセッション SRR23314099、SRR23314100、SRR23314101、および SRR23314102 として入手できます。

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この研究は、2023年度の研究プログラムに基づき、コンケン大学の研究および大学院研究および付加価値農産物発酵研究センター（FerVAAPs）から財政的支援を受けました。

2023年度の研究プログラムに基づく、コンケン大学の研究および大学院研究および付加価値農産物発酵研究センター（FerVAAPs）。

コンケン大学技術学部バイオテクノロジー学科、コンケン、40002、タイ

リー・トゥ・プン、ハルタイラット・キットウェチャロエン、ヌッタポーン・チャムニパ、ノンラック・ブーンチョット、プレーカモール・クランリット、ポーンタップ・タノンケオ

ワライ・ルカヴェジ植物研究所、マハーサーラカーム大学、マハーサーラカーム、44150、タイ

スダラット・タノンケオ

コンケン大学付属医科学部、コンケン、40002、タイ

パッチャラポーンティパヤワット

付加価値農産物発酵研究センター (FerVAAPs)、コンケン大学、コンケン、40002、タイ

プリーカモル・クランリット & ポーンタップ・タノンケオ

山口大学農学部生物化学科（〒753-8315 山口県山口市）

Mamoru Yamada

山口大学耐熱微生物資源研究センター、〒753-8315 山口市

Mamoru Yamada

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LTP は実験を実施し、データを分析しました。 HK と NC は植物サンプルを収集し、植物材料の化学組成を分析しました。 NB はコンブチャ SCOBY から全ゲノム DNA を調製し、DNA の品質を決定しました。 PT (Patcharaporn Tippayawat) は、抗菌アッセイ用にグラム陰性菌とグラム陽性菌を提供しました。 ST はアイデアを考え出し、データを分析し、元の草稿を書きました。 MY が実験を監督し、設計しました。 PK と PT (Pornthap Thanonkeo) がアイデアを考案し、実験を設計し、データを分析し、原稿を修正して提出しました。著者全員が原稿の最終版を読んで承認しました。

ポーンタップ・タノンケオ氏への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Phung, LT、Kitwetcharoen, H.、Chamnipa, N. 他紅茶とパイナップルの皮と芯から作られたコンブチャ飲料の化学組成と生物学的特性の変化。 Sci Rep 13、7859 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-34954-7

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受信日: 2023 年 2 月 3 日

受理日: 2023 年 5 月 10 日

公開日: 2023 年 5 月 15 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34954-7

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