鉄過剰症の改善における Alnus incana (L.) Moench 抽出物の効果

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7635 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

鉄分の過剰摂取は多臓器不全や深刻な損傷を引き起こします。北アメリカに広く分布するカバノキ科の Alnus incana は、病気の治療に使用されます。この研究では、鉄過剰ラットを用いてアルヌス・インカナの総抽出物とブタノール抽出物の鉄キレート作用、抗酸化作用、抗炎症作用、抗アポトーシス作用を調査し、液体クロマトグラフィー質量分析法を用いて両抽出物中の生物活性成分を同定した。我々は、体重100g当たり12.5mgの鉄デキストランを30日間6回筋肉内注射することにより、ラットに鉄過剰を誘発した。次いで、胃管を使用してラットに体重１ｋｇ当たり６０ｍｇの硫酸第一鉄を１日１回投与した。総抽出物とブタノール抽出物は経口投与され、参照薬物 (デフェロキサミン) はさらに 1 か月間皮下投与されました。 2 か月後、生化学的、病理組織学的、組織化学的、免疫組織化学的パラメーターを評価しました。鉄過剰は、血清鉄レベル、肝臓バイオマーカー活性、肝臓鉄含有量、マロンジアルデヒド、腫瘍壊死因子α、およびカスパーゼ-3レベルを有意に増加させた。また、血清アルブミン、総タンパク質、総ビリルビン含量も大幅に（P < 0.05）減少し、肝臓のグルタチオンレベルも減少しました。それは対照ラットと比較して重度の組織病理学的変化を引き起こしたが、治療後に顕著に（P < 0.05）改善された。全抽出物は、ブタノール抽出物よりも著しく高い抗炎症活性および抗アポトーシス活性を示したが、抗酸化活性および鉄キレート活性は低かった。フラボノイドやフェノール酸を含むいくつかのポリフェノール化合物は、超高性能液体クロマトグラフィー、エレクトロスプレーイオン化、四重極飛行時間型質量分析 (UPLC-ESI-QTOF-MS) 分析によって検出されました。我々の発見は、両方の抽出物が鉄過剰誘発性肝毒性や、サラセミアや鎌状赤血球貧血などの肝鉄過剰を特徴とする他の病理学的状態を軽減する可能性があることを示唆しています。

鉄過剰毒性は、遺伝性ヘモクロマトーシス、サラセミア、慢性肝炎やアルコール性肝炎などの肝疾患と関連性があります1。ホモ接合性 β サラセミア患者のほとんどは、定期的な生体輸血を必要とする重度の進行性貧血を患っていますが、輸血に依存しない患者もいます 2。慢性的な輸血と胃腸での吸収の増加により、鉄は多くの臓器や組織に蓄積し、肝臓、心臓、内分泌腺などの進行性の多臓器不全を引き起こします3。診断されていない鉄過剰はヘモクロマトーシスを引き起こす可能性があり、臓器内に蓄積された過剰な鉄が重度の組織損傷を引き起こします。さらに、赤身肉と鉄サプリメントの広範な摂取により、鉄過剰症は先進国で一般的に見られます4。病因的には、多臓器不全は過剰な遊離鉄の存在に関連しており、これが活性酸素種 (ROS) を生成し5、細胞内の抗酸化物質レベルを枯渇させることで酸化損傷を増大させます6。肝細胞内の鉄の沈着は線維症や肝硬変のリスクを大幅に高め、その結果、罹患率と死亡率が増加します7。さらに、遊離した ROS は、核因子カッパ B (NF-κB) や腫瘍壊死因子アルファ (TNF-α) などの特定の炎症誘発性メディエーターを誘導することによって肝臓の炎症を引き起こす可能性があり、これらは急性および慢性肝臓の両方の病因および発症に寄与します。損傷、肝硬変に至る8. したがって、過剰な鉄の蓄積を防ぎながら適切な鉄供給を維持することにより、鉄の恒常性を維持する必要があります。

現在使用されているデフェリプロン、デフェロキサミン、デフェラシロクスなどの鉄キレート剤には、無顆粒球症、肝不全または腎不全、眼毒性、聴器毒性、成長遅延など、いくつかの望ましくない副作用があります9,10。

製造された医薬品と比較して、漢方薬はより安全であり、副作用が少ないです。さらに、いくつかの植物には、強力な薬理活性を持つ生理活性化学物質が豊富に含まれています11、12。カバノキ科に属するアルヌス属には、約 30 種の樹木とつる植物の種が含まれます。 Alnus incana (L.) Moench は北半球に広く分布しており、胃腸疾患や皮膚疾患の治療に使用されています13。また、細菌による口や喉の感染症の際のうがいにも使用されます14。この種には、抗炎症作用、抗インフルエンザ作用、肝保護作用など、さまざまな薬理活性を持つジアリールヘプタノイドとして知られる天然化合物が含まれていることが報告されています。 Sajid ら 15 および Kim ら 16 は、それぞれ近縁種である Alnus nitida および Alnus japonica の肝保護活性を報告しましたが、この活性は A. incana 抽出物ではまだ報告されていません。

最近、科学者らは、サラセミア患者の鉄分除去に使用するために、フェノール含有量が高く強力な抗酸化活性を持つ天然のキレート性植物化学物質を豊富に含む薬用植物の研究を進めています17,18。したがって、この研究では、ラットにおける鉄過剰媒介肝毒性に対する、Alnus incana の葉からの全メタノール抽出物とブタノール画分の肝臓保護、鉄キレート、抗酸化、抗炎症、および抗アポトーシス活性の可能性を調査しました。また、超高性能液体クロマトグラフィー、エレクトロスプレーイオン化、四重極飛行時間型質量分析 (UPLC-ESI-QTOF-MS) 分析を使用して、両方の抽出物中の生物活性成分を同定しました。

全抽出物の植物化学分析により、タンニン、フェノール化合物、フラボノイド、アルカロイド、サポニン、クマリン、テルペノイド、アントラキノン、およびβ-シアニンの存在が示されました (表 1)。

ブタノールおよび全抽出物は、2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル (DPPH) 活性の用量依存的な阻害を示し、最大阻害濃度の半分 (IC50) 値はそれぞれ 0.015 および 7.55 µg/ml でした。一方、石油エーテルおよび塩化メチレン画分の IC50 は、それぞれ 229 および 29.06 μg/ml でした。全抽出物とブタノール画分の両方のすべての濃度が、塩化メチレンおよび石油エーテル画分と比較してフリーラジカルを有意に抑制しました（P < 0.05）（図 1）。したがって、我々は、雄のアルビノラットにおける鉄過剰によって誘発される肝毒性に対する総アルヌス・インカナ抽出物およびブタノール画分の潜在的な改善効果を評価した。

さまざまな A. インカナ抽出物の DPPH 消去活性と標準ルチンの比較。データは、3 回の実験の平均値 ± SEM として表されます。 a 石油エーテル抽出物とは大きく異なります。 b 塩化メチレン抽出物とは大きく異なります。

全抽出物の総フェノールおよびフラボノイド含有量は、それぞれ 125.88 ± 10.5 mg 没食子酸当量 (GAE) /g および 122.4 ± 11.5 mg カテキン当量 (CE) /g であることが判明しましたが、ブタノール画分の含有量は 245 ± 1g でした。それぞれ、18.5 GAE/g および 100 ± 9.8 mg CE/g (表 2)。

A. incana の総抽出物とブタノール画分では、それぞれ、フラボノイド (35、29)、フェノール酸 (8、7)、スチルベン (1、1)、クマリン (2、2) を含む 50 および 43 のポリフェノール化合物が同定されました。、ジアリールヘプタノイド (4、4) がそれぞれ含まれます (表 3)。フラボノイドは、アグリコンと、フラボノール、フラボン、イソフラボン、フラバノン、カルコン、およびアントシアニジンの O- または C- グリコシドで構成されていました。スチルベン、カルコンアントシアニジンおよびフェノール酸は、全抽出物と比較したブタノール画分中の最高濃度のクラス (それぞれ 800.38%、247.81%、247.29%、242.39%、および 101.49%) でした。さらに、ダイゼイン-8-C-グルコシド、マルビジン-3-グルコシドおよびオレゴニンは、ピーク面積から計算された全抽出物と比較して、ブタノール画分に最も多く存在する化合物でした（表3）。

A. インカナの全抽出物およびブタノール画分から同定されたフラボノイドには、ケルセチン、ミリセチン、バイカリン、バイカレイン、アピゲニン、ナリンゲニン、プエラリン、およびマルビジン-3-グルコシドが含まれており、これらはライブラリーデータベースと入手可能な文献を検討することによって質量スペクトルから同定されました (図補足 1)。

実験期間全体を通じて、最大 1000 mg/kg 体重 (bw) の用量で急性毒性および死亡の兆候は観察されませんでした。したがって、さらなる研究のために、ブタノール画分の用量は 100 mg/kg 体重として選択されました。

鉄過剰摂取グループでは、他のグループと比較して、アルブミンおよび総タンパク質レベルが大幅に（P < 0.05）減少し、総ビリルビンレベル、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）活性が顕著に（P < 0.05）上昇していることが明らかになりました。それらのコントロール (表 4)。両方の抽出物と参照薬物による治療は、鉄過剰ラットと比較して、アルブミンおよび総タンパク質レベルを顕著に上昇させ(P < 0.05)、総ビリルビンレベル、ALT、およびAST活性を有意に(P < 0.05)減少させた。さらに、ブタノール抽出物は、参照薬物処理ラットよりも実質的に高いレベルの上記パラメータを示した。

鉄過剰群では、対照群よりも血清および肝臓の鉄含有量がかなり高いことが明らかになりました（P < 0.05）。しかし、総抽出物、ブタノール画分、およびデフェロキサミンを鉄過負荷ラットに投与すると、鉄過剰群と比較してこれらのパラメータが有意に減少した(P < 0.05)。ブタノール抽出物で処理したラットの血清鉄レベルは、参照薬物で処理したラットのレベルとの有意差（P > 0.05）がなく、抽出物で処理した全ラットの血清鉄レベルよりも実質的に低かった（P < 0.05）。ブタノール抽出物処理は、総抽出物および参照薬物で処理したものと比較して肝臓の鉄含有量を有意に減少させました（P < 0.05）（図2aおよびb）。

異なる実験グループ間の肝鉄含有量（a）、血清鉄レベル（b）、GSH（c）、MDA（d）、TNF-α（e）、およびカスパーゼ-3（f）レベル。 C：対照群、鉄過剰：鉄過剰群、鉄過剰＋T：鉄過剰＋全抽出物処理群、鉄過剰＋B：鉄過剰＋ブタノール画分処理群、鉄過剰＋D：鉄過剰＋デフェロキサミン-治療を受けたグループ。結果は平均±SEM (n = 6 ラット/グループ) として表されます。対照とは有意に異なり、鉄過剰群とは有意に異なり、鉄過剰＋Ｂ群とは有意に異なり、鉄過剰＋Ｄ群とは有意に異なる。

鉄投与は、正常対照と比較して、肝臓のマロンジアルデヒド（MDA）含量を実質的に上昇させ、同時に肝臓の還元型グルタチオン（GSH）含量を減少させた（P < 0.05）。両方の抽出物と参照薬物による治療では、鉄治療ラットと比較して MDA 含有量が大幅に減少し、GSH 含有量が増加しました (P < 0.05)。 MDA レベルの減少は、全抽出物よりもブタノール抽出物の方が顕著に高かった。対照的に、ブタノール抽出物による処理は、対照群と比較してGSHレベルに有意差を示さなかった（P > 0.05）（図2cおよびd）。

鉄過剰は、対照値と比較して肝臓のTNF-αレベルとカスパーゼ-3活性を有意に増加させました（P < 0.05）（図2eおよびf）。逆に、総抽出物、ブタノール画分、および参照薬物を鉄過負荷動物に投与すると、鉄過負荷ラットと比較してこれらのパラメーターが実質的に減少した(P < 0.05)。全抽出物で処理したラットは、ブタノール画分で処理したラットよりも有意に低い（P < 0.05）TNF-αレベルおよびカスパーゼ-3活性を示しました。

対照ラットからの肝臓切片は、正常な組織学的構造を示した。肝臓は、肝類洞によって分離された規則的な肝プレートを備えた中心静脈で構成されていました。各肝プレートには、中心核が丸く小胞状の核を持つ大きな多角形の肝細胞が含まれていました（図3a）。しかし、鉄過剰負荷ラットは、中心静脈および肝類洞の拡張およびうっ血、乱れた肝索、細胞質空胞化を伴う肝細胞変性、黄褐色の鉄沈着、肝細胞間および門脈領域における炎症性細胞浸潤などの重度の肝損傷を示した。門脈の拡張とうっ血を伴います（図3b〜f）。逆に、共治療群では、鉄過剰により誘発される肝損傷が顕著に軽減されたことが明らかになりました。アルヌス・インカナの全抽出物を同時投与した鉄過剰ラットは、中心静脈の軽度の拡張とうっ血、および軽度の肝細胞変性を伴う組織学的構造の顕著な改善を示しました（図3g）。グループIVの肝臓切片は、中心静脈の軽度の拡張と鬱血、および軽度の肝細胞変性のみを伴う、明らかに正常な肝実質を示しました（図3h）。対照的に、デフェロキサミンとの同時投与は、軽度の肝細胞変性と細胞質の空胞化とともに、まっすぐに配置された肝索、中程度の拡張、中心静脈のうっ血を伴う肝実質を著しく回復させました（図3i）。

さまざまな実験グループの肝臓組織切片の代表的な顕微鏡写真（H&E、× 400）：（a）肝類洞（矢印）によって分離された中心静脈（CV）および規則的な肝臓プレート（矢印）を備えた肝臓組織の正常な組織学的構造を示す対照グループ（ b:f) 中心静脈（星形）および肝類洞（白矢印）の拡張およびうっ血、乱れた肝索、細胞質空胞化を伴う肝細胞変性（白矢印）、黄褐色の鉄沈着などの重度の肝損傷を示す鉄過剰群(黄色の矢印)、肝細胞間 (丸) および門脈領域 (黄色の矢印) での炎症細胞の浸潤、および門脈 (PV) の拡張および鬱血。 (g:i) 共治療群 (III、IV、V) は、鉄蓄積の減少を伴う鉄過剰誘発性肝損傷の顕著な軽減を示しています (黄色の矢印)。（g）Alnus incanaの総抽出物で同時治療した鉄過剰群は、中心静脈（星印）の軽度の拡張と鬱血、および軽度の肝細胞変性（白い矢印）を伴う組織学的構造の顕著な改善を示しました。 (h) Alnus incana のブタノール抽出物で同時処理した鉄過剰群は、中心静脈 (星印) の軽度の拡張と鬱血、および軽度の肝細胞変性 (白い矢印) のみを伴う、一見正常な肝実質を明らかにしています。 (i) デフェロキサミンと同時治療した鉄過剰群は、軽度の肝細胞変性および細胞質空胞化 (白い矢印) とともに、まっすぐに配置された肝索 (矢印)、中程度の拡張、および中心静脈のうっ血 (星) を伴う肝実質を著しく回復しました。

我々の結果(表5)は、最も高い組織病理学的病変スコアが鉄過剰群(II)で観察されたことを示した。対照的に、共治療グループ (III、IV、および V) では、すべての顕微鏡的病変スコアの顕著な減少が明らかになりました。

肝組織切片における鉄沈着の分布を視覚化し、異なる実験グループ間の変動を確認するために、プルシアン染色を実行しました。対照群の肝臓切片には鉄の沈着は見られませんでした (図 4a)。逆に、他の処理グループでは、青色の色素は肝細胞の細胞質、間質、門脈領域の鉄沈着物を表していました（図4b-m）。他の同時治療群（図4e〜m）と比較して、鉄過剰ラットで最も高い肝臓鉄蓄積が観察され、平均面積％（33.92±0.57、図4n）でした（図4b〜d）。一方、総抽出物（図4e〜g）およびブタノール抽出物（図4h〜j）、ならびにデフェロキサミン（図4k〜m）による治療は、肝臓の鉄蓄積を平均面積％（21.25±0.78）で顕著に（P < 0.05）軽減しました。、18.33 ± 0.59、および22.59 ± 0.47、それぞれ、図4n）。

さまざまなグループの肝臓組織切片におけるプルシアンブルー染色された鉄沈着物の分布 (a ～ m) と定量 (n) を表す顕微鏡写真。 (a) 対照群、(b:d) 鉄過剰群、(e:g) Alnus incana の全抽出物で共処理した鉄過剰群、(h:j) ブタノール抽出物で共処理した鉄過剰群、(k) :m) デフェロキサミンで同時治療した鉄過剰群。 (a,b,e,h,k:×100) (c,f,i,l:中央部高倍率、×400) (d,g,j,m:門脈部高倍率、× 400）。 (n) ラットの肝臓組織におけるプルシアンブルー染色陽性領域%の定量化。結果は、平均±SEMとして表されます。対照とは有意に異なり、鉄過剰群とは有意に異なり、鉄過剰+Bグループとは有意に異なり、鉄過剰+Dグループとは有意に異なりません。

鉄過剰群の肝臓切片（図5b）は、対照群（図5a）よりもカスパーゼ3に対して強い陽性免疫反応性を示しました。一方、全抽出物またはブタノール画分またはデフェロキサミンで共処理した鉄過剰群は、グループIIと比較して中程度のカスパーゼ3免疫反応性を明らかにしました（それぞれ図5c〜e）。

カスパーゼ 3 の顕微鏡写真 - 異なる実験グループのラットの染色肝臓切片 (× 400)。 (a) 対照群、(b) 鉄過剰群、(c) Alnus incana の全抽出物で共処理した鉄過剰群、(d) ブタノールと共処理した鉄過剰群、および (e) 鉄過剰群デフェロキサミンで治療します。

鉄過剰群の肝臓切片（図6b）は、対照群（図6a）よりもNF-κBに対して高い陽性免疫反応性を示しました。逆に、総抽出物（グループIII）またはブタノール画分（グループIV）、またはデフェロキサミン（グループV）で共処理した鉄過剰群は、グループIIよりも穏やかなNF-κB免疫反応性を明らかにしました（それぞれ図6c〜e）。

NFκB の顕微鏡写真 - 異なる実験グループのラットの染色肝臓切片 (× 400)。 (a) 対照群、(b) 鉄過剰群、(c) Alnus incana の全抽出物で共処理した鉄過剰群、(d) ブタノールと共処理した鉄過剰群、および (e) 鉄過剰群デフェロキサミンで治療します。

今回の結果では、肝臓の鉄レベルが肝臓のTNF-α、カスパーゼ-3、MDA、血清鉄レベル、ALT、AST、総ビリルビンレベルと有意に相関していることが明らかになった（r = 0.813**、0.833**、0.798**）。、0.823**、0.845**、0.813**、0.910** です。一方、肝鉄含量と肝 GSH 含量、血清アルブミン、総血清タンパク質の間には、r = − 0.798** − 0.87** および− 0.869** で有意な負の相関が観察されました (**P < 0.01）。同様に、血清鉄レベルは肝臓の TNF-α、カスパーゼ-3、MDA、ALT、AST、総ビリルビンレベルと有意に相関しました。ここで、r = 0.791**、0.750**、0.933**、0.792**、0.786*それぞれ *、0.865**。また、血清鉄レベルは、肝臓GSH、血清アルブミン、および総タンパク質と負の相関があり、r = - 0.798**、-0.830**、および-0.779**、（**P < 0.01）。

必須微量元素である鉄は、生物においていくつかの重要な役割を果たしています19,20。しかし、中毒、病気、病理学的状態によって発生する鉄過剰は、肝臓損傷を含む多臓器不全を引き起こす可能性があります21。現在使用されているデフェリプロン、デフェロキサミン、デフェラシロクスなどの鉄キレート剤は、無顆粒球症、好中球減少症、胃腸障害、肝不全や腎不全など、いくつかの望ましくない副作用を引き起こします9,10。現在の鉄キレート剤のこれらの欠点は、代替的で安全な薬理学的介入の革新を浮き彫りにしています。 Ebrahimzadeh ら 18 は、フェノール含有量の高いハーブ抽出物が鉄過剰を治療するためのキレート剤またはアジュバントとして機能する可能性があることを示しました。したがって、ここでは、鉄過剰誘発性肝毒性に対する、Alnus incana の葉からのメタノール抽出物とそのブタノール画分の抗酸化作用、鉄キレート作用、抗炎症作用、および抗アポトーシス作用を評価しました。

我々の結果は、過剰な鉄摂取により血清および肝臓の鉄レベルが上昇し、肝機能および脂質過酸化の重大な変化を伴うことを示した。その後、これにより抗酸化防御機構が欠損し、肝臓組織のアポトーシスが引き起こされました。これらの発見は、Badria ら 22 および Al-Basher 23 と一致しています。

我々の結果に基づいて、鉄過負荷ラットでは、Al-Basher 23 と一致して、血清 ALT および AST 酵素活性と総ビリルビンレベルが大幅に上昇しているが、血清アルブミンと総タンパク質が低下していることが明らかになりました。さらに、肝鉄含有量は肝血清ALT、AST、総ビリルビンレベルと有意な相関があり、それぞれr = 0.845**、0.813**、0.910**でした（**P < 0.01）。一方、肝臓の鉄含量は血清アルブミンおよび総血清タンパク質と負の相関があり、それぞれ r = − 0.87** および − 0.869** でした (**P < 0.01)。これらの結果には、肝鉄蓄積の平均面積% (33.92 ± 0.57) の有意な増加、ならびに拡張の形での重篤な病理組織学的変化、中心静脈および肝類洞のうっ血、乱れた肝索、肝細胞変性が伴っていました。細胞質空胞化、炎症細胞浸潤。これらの発見は、Jahanshahi et al.24 および Wang et al.25 と一致しています。肝機能の大幅な上昇は肝損傷を示しており、その後肝細胞の輸送機能に影響を及ぼし、肝細胞の漏出により ALT と AST が放出されます 26,27。さらに、これらの組織病理学的変化は肝機能に影響を及ぼし、低アルブミン血症や低タンパク質血症を引き起こす可能性があります。さらに、過剰な鉄分は肝細胞の重大な機能障害を引き起こし、正常な取り込み、抱合、排泄の失敗、そしてその後の総ビリルビンレベルの上昇につながります28。

しかし、両方の抽出物の投与は、鉄過剰ラットと比較して、AST、ALT活性、および総ビリルビンのレベルを著しく低下させ、アルブミンおよび総タンパク質レベルを増加させた。ブタノール抽出物で治療したグループでは、パラメーターは正常範囲に回復し、肝実質構造が大幅に改善され、肝鉄沈着物の平均面積％が顕著に減少しました。これらの発見は、フリーラジカル消去活性の測定によって証明されるように、両方の抽出物の強力な抗酸化作用を示唆しています (図 1)。これらの抗酸化効果は、これらの抽出物に含まれるフラボノイドとポリフェノールの存在によるものである可能性があり、肝臓の細胞膜を安定化および維持し、肝細胞の再生を刺激し、損傷した組織を弱毒化および修復し、その後肝臓の酵素活性を高めることができます。および肝細胞タンパク質の合成29、30。さらに、ブタノール投与は、全抽出物および参照薬剤で治療したものと比較して肝臓の鉄含有量を有意に減少させ、鉄過剰ラットにおいて全抽出物よりも優れた鉄キレート活性を有することを示唆している。

A. インカナの全抽出物とブタノール画分の植物化学的プロファイルは、UPLC-ESI-QTOF-MS 分析を使用して同定されました。データは、全抽出物とブタノール画分にはさまざまなポリフェノールとジアリールヘプタノイドが豊富に含まれていることを示しました。

ブタノール画分の最も高い鉄キレート活性は、この画分中のダイゼイン-8-C-グルコシド、マルビジン-3-グルコシド、およびオレゴニンが抽出物全体よりも豊富に含まれていることに起因すると考えられます（表3）。前述の化合物は、異なる作用機序を介して鉄キレート活性を示したことが報告されています 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42。さらに、フラボノイドは、A.incana 抽出物に含まれる主要な成分として同定されており、他のポリフェノールより効率的に金属をキレート化できることから、フラボノイドが鉄過剰症の治療に使用できる可能性があることが示唆されています。 Wang et al.42 によると、フラボノイドは次の 3 つの主なメカニズムを通じて鉄の蓄積に対抗します。(1) フェリチンやヘプシジンなどの複数のタンパク質や経路を介して間接的に鉄飽和を低下させます。 (2) 鉄をキレートして鉄蓄積を減少させ、6,7-ジヒドロキシ構造、B-環カテコール、2,3-二重結合などの結合部位を介して鉄飽和を直接減少させます。バイカリン、バイカレイン、およびケルセチンも、顕著な鉄キレート活性を示すことが報告されています。 (3) スーパーオキシドアニオンラジカルと反応してフリーラジカルの開始を防ぎ、フェントン反応を抑制してヒドロキシルラジカルの生成を防ぎ、脂質過酸化基と反応して脂質の過酸化を防ぐことにより、鉄過剰による酸化損傷を軽減する酸化耐性。この効果は、抽出物全体よりもブタノール抽出物中のポリフェノールの量が多いためである可能性があります (表 2)。ポリフェノールは、フリーラジカル消去能や鉄結合などのさまざまなメカニズムを通じて抗酸化活性を発揮します。一般に、鉄を含む遷移金属は酸素フリーラジカルの生成を促進し、過酸化物を還元し、スーパーオキシドアニオンと相互作用して酸化ストレスを引き起こします。ポリフェノールには鉄と結合する能力があることがわかっています。これらの活性は主にカテコールやガロイルなどの基の存在によるものです。さらに、いくつかの研究により、6,7-ジヒドロキシ構造、B環カテコール、ガロイル基、2,3-二重結合、3-および5-ヒドロキシル基が4-ケト基と共存していることが明らかになりました。はキレート化能力に関連しているため、鉄結合部位として考慮する価値があります42。

この研究では、過剰な肝臓の鉄含有量は、対照群と比較して、鉄過剰群の肝臓のGSHレベルの顕著な（P〜0.05）減少とともに、肝臓のMDA含有量の実質的な上昇（P〜0.05）を引き起こした。これらの所見は、脂質過酸化の促進、過剰なフリーラジカル形成、抗酸化機構の欠如による酸化ストレスを示しており、これがその後肝機能障害や肝酵素の漏出を引き起こす43,44。 Papanikolaou と Pantopoulos 45 は、過剰な鉄がフリーラジカルを生成し、細胞高分子への損傷を誘発し、細胞死を促進することを示しました。我々の結果は、肝臓の鉄含有量とMDAレベルの間の有意な相関（r = 0.798**）、および肝臓の鉄含有量とGSH含有量の間の負の相関（r = − 0.798 **）を示唆しています。逆に、鉄過剰ラットと比較して、GSH含有量の顕著な上昇（P〜0.05）およびMDAレベルの有意な低下（P〜0.05）によって証明されるように、全抽出物およびブタノール画分による処理は、誘発された酸化ストレスを軽減した。これらの結果は、両方の抽出物に含まれる抗酸化物質に起因すると考えられます。ブタノール抽出物は、全抽出物よりも優れた抗酸化効果を示しました。この画分には全抽出物 (126 mg GAE/g、表 2) よりも高いポリフェノール含有量 (245 mg GAE/g) が含まれているため、抗酸化活性はポリフェノール濃度と相関します 46。天然ポリフェノールは、フリーラジカルを除去し、金属をキレート化し、一次酸化生成物を非ラジカル分子に変換し、鎖を切断して基質からの水素の継続的な損失を防ぎ、抗酸化酵素を調節できるため、強力な抗酸化物質です47。

我々の研究では、鉄過剰により誘発されるアポトーシスは、肝臓カスパーゼ 3 活性の顕著な上昇 (P ~ 0.05) を伴う強力なカスパーゼ 3 免疫反応性によって現れることが確認されました。これは肝臓の鉄含量と実質的に相関していた。以前の研究では、過剰な鉄誘発酸化ストレスがミトコンドリア内膜の損傷を引き起こし、ミトコンドリア孔の開口を開始することが実証されました。その結果、アデノシン三リン酸 (ATP) が枯渇し、シトクロム c がサイトゾルに放出され、その後カスパーゼ 3 が活性化されて細胞死が誘導されます 8,48。重要なアポトーシスメディエーターであるカスパーゼ 3 の活性化は、細胞内で DNA 断片化とアポトーシス性クロマチン凝縮を引き起こします 49。したがって、過剰な鉄は、単独で、または酸化ストレスと組み合わせて、肝細胞の壊死またはアポトーシスを促進します48。さらに、我々の結果は、鉄過剰群では強力なNF-κB免疫組織化学的発現を伴う有意に高い（P〜0.05）肝臓TNF-α活性が明らかになったことから、炎症が鉄過剰誘発性肝毒性の別の考えられる機序であることを実証した。 Handa ら 50 は、過剰な鉄補給は肝細胞の酸化ストレスを誘発し、炎症性メディエーターと免疫メディエーターの両方、ならびに肝細胞のバルーニング損傷を開始し、その結果非アルコール性脂肪性肝炎の予後がもたらされると報告しました。多機能サイトカインである TNF-α は、炎症、アポトーシス、壊死などのさまざまな生理学的および病理学的メカニズムに重要です 51。さらに、TNF-α は、Toll 様受容体を活性化することによって NF-κB シグナル伝達経路を活性化し、その結果、NF-κB の免疫組織化学的発現が増加します 52,53。 NF-κB の活性化は、炎症に関係する一連の炎症性サイトカインの発現を開始し、調節することができます 54,55。さらに、NF-κB は、ROS およびインターロイキン 1 ベータ 56 を含む多くのサイトカインの過剰な生成によって制御されます。我々の結果は、両方の抽出物が、軽度のNF-κB免疫反応性、中程度のカスパーゼ3免疫発現によって表される強力な抗炎症活性および抗アポトーシス活性を有し、鉄過剰群よりも肝臓TNF-αおよびカスパーゼ3活性が実質的に（P〜0.05）低いことを実証しました。これは、これらの抽出物の強力な抗酸化能力と、肝臓の鉄分をキレート化して阻害する能力に起因すると考えられます。さらに、全抽出物はブタノール抽出物よりも高い抗炎症作用と抗アポトーシス作用を示しました。これはおそらく、抗炎症作用と抗炎症作用を示すフェノール酸、フラボノイド、スチルベン、クマリン、リグニン、タンニンなどのいくつかのポリフェノール化合物の相乗効果によるものと考えられます。抗アポトーシス活性57、58、59、60、61、62。さらに、同様の活性を示す他のクラス、すなわちサポニン、テルペノイド、アントラキノン、ジアリールヘプタノイド 63、64、65、66 もこの抽出物で検出されました (表 1)。

我々の結果は、Mansi et al.20、Jahanshahi et al.24、Wang et al.25と一致して、デフェロキサミン治療が血清および肝臓の鉄含有量と肝臓バイオマーカー（ASTおよびALT）を有意に減少させることを示しています。さらに、この治療により、Wang et al.25 と一致して、MDA、TNF-α、およびカスパーゼ-3 のレベルの上昇が大幅に減少し、GSH 含有量が増加しました。さらに、デフェロキサミンは、肝臓の鉄沈着を大幅に軽減し、肝損傷を改善し、鉄過剰によって誘発されるカスパーゼ-3およびNF-κBの免疫反応性を低下させました。これは、Jahanshahi et al.24およびWang et al.25の観察と一致しています。これらの結果は、その強力なキレート活性によるものと考えられます。 Heliら67は、鉄キレート剤が標的組織から過剰な鉄を除去することによって酸化ストレスを軽減できると報告した。

私たちの研究は、Alnus incana からの総抽出物とブタノール抽出物の両方が過剰な鉄を顕著にキレート化し、血清と肝臓の鉄含有量、肝臓のバイオマーカー活性を低下させ、酸化ストレスを軽減し、炎症とアポトーシスを阻害することにより、ラットの鉄過剰誘発性肝毒性を改善することができることを実証しました。血清アルブミン、総タンパク質、総ビリルビン含有量が大幅に増加し、内因性抗酸化活性が向上しました。さらに、植物化学物質の含有量により、鉄過剰によって誘発される組織病理学的および組織化学的変化を軽減することができます。これらの発見は、両方の抽出物が、鉄過剰誘発性肝毒性や、サラセミアや鎌状赤血球貧血などの肝鉄過剰を特徴とする他の病理学的状態に対する新規治療法となる可能性があることを示唆しています。

すべての化学物質は高分析グレードであり、Sigma-Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス) から入手しました。デフェロキサミンは、Novartis Pharma AG (スイス、バーゼル) から購入しました。

Alnus incana (L.) Moench の葉は、機関、国内、および国際ガイドラインに従って、Al Zoharia Research Garden の許可を得て収集されました。エジプト、カイロにあるアル・ゾハリア・リサーチ・ガーデンの植物学者、マムドゥ・ショクリ博士は、その植物材料を検証し、認証しました。バウチャー標本は、アル・アズハル大学薬学部（女子）生理学研究室の植物標本館に番号（AR-2016）で寄託されました。

風乾した植物材料（１ｋｇ）を、１００％メタノール（３×、３Ｌ）で十分に浸軟化することによって抽出し、濾紙（ワットマン番号１）を通して濾過した。収集した濾液をロータリーエバポレーターにより真空下(45℃)で乾燥させ、全抽出物を得た。次に、全抽出物 350 g を蒸留水に懸濁し、石油エーテル、塩化メチレン、n-ブタノールなどの極性勾配溶媒を使用して連続的に分別しました。画分を濾過し、ロータリーエバポレーターにより適切な温度で蒸発させて、石油エーテル（６０ｇ）、塩化メチレン（２２０ｇ）、およびｎ−ブタノール（１２ｇ）画分を得た。

68 によると、Alnus incana の葉からの総抽出物とブタノール抽出物中のさまざまな植物化学クラスを検出するために定性テストを実行しました。

総フェノール含有量は、Folin-Ciocalteu 法を使用して決定されました69。総フラボノイド含有量は、USSR70 の国家薬局方を使用して定量化されました。

UPLC-ESI-QTOF-MS は、植物の二次代謝物を定性的および定量的に同定するための高度で高感度な技術です。ネガティブ ESI 技術を適用して、A. incana の全抽出物およびブタノール画分中のさまざまな植物成分を検出しました。

A.インカナ全抽出物およびブタノール画分(100mg)を、2分間ボルテックスし、10分間超音波処理することにより、2mLのメタノール:アセトニトリル:水(1:1:2)に溶解した。 10,000 rpm で 10 分間遠心分離した後、溶液を最終濃度 2.5 μg/μL に達するまで希釈しました。次に、10 μL をネガティブモードで注入しました。インラインフィルターディスクプレカラム (0.5 μm × 3 mm、Phenomenex、米国) および Xbridge C18 (3.5 μm × 2.1 mm × 50 ｍｍ）カラム（ＷａｔｅｒｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国マサチューセッツ州ミルフォード）を４０℃、流速３００μＬ／分に維持した。 1% メタノール (pH = 8) 中の 5 mM ギ酸アンモニウムと 100% アセトニトリルからなる移動相を使用して、勾配溶出を適用しました。 ESI モードで動作する Duo Spray™ ソースを備えた Triple TOF™ 5600 + システム (AB SCIEX、カナダ、コンコード) を MS 分析に使用しました。各スキャンの後、MS/MS フラグメンテーションスペクトルを取得するために、上位 15 個の強力なイオンが選択されました。標的分析物は、LC/MS データを参照データベース (ReSpect ネガティブ、1573 レコード) および以前に公開された化合物と関連付けることによって認識されました 71。

抽出物のフリーラジカル消去能力は、72 によって記載された方法によって評価されていました。すべての抽出物の IC50 はプロビット分析によって決定されました 73。

60 匹の雄の Wistar ラット (210 ～ 230 g) を国立薬物管理研究機構の動物舎から入手しました。これらは、規則的な明暗サイクル (12/12 時間)、室温 25 °C ± 1 °C、相対湿度 50% ± 4% などの標準環境条件下で保管されました。適切な換気を伴う自然光サイクルの下で 1 週間順応させた後、標準的なペレット食を与え、水は無制限に摂取させました。

30 匹のラットを 5 つのグループに均等に割り当てました (1 グループあたり 6 匹のラット)。全ての群に、ブタノール画分の用量を増加させて（125、250、500、および1000 mg/kg体重）経口投与した。ビヒクルのみを投与した群は、正常対照としての役割を果たした。 1時間後、眠気、落ち着きのなさ、もがき、けいれん、その他の毒性や死亡の症状など、異常な行動変化がないかどうかラットを個別に観察した。その後、14 日間、急性毒性症状がないかどうか 24 時間ごとに断続的にモニタリングされました 74。

すべての実験プロトコールは、カイロ大学獣医学部の施設内動物管理使用委員会 (IACUC) によって承認され (承認番号: Vet Cu 2009 2022484)、国立衛生研究所のガイドラインに準拠していました。すべての方法は ARRIVE ガイドラインに従って実行されました。

30 匹のラットを以下のように 5 つのグループ (1 グループあたり 6 匹のラット) に均等に割り当てました。

対照群のラットは蒸留水で飼育した。

鉄過剰負荷群のラットには、体重 100 g あたり 12.5 mg の鉄デキストランを 30 日間均一に 6 回筋肉内注射しました。一方、ラットには胃管を使用して体重1kg当たり60mgの硫酸第一鉄を1日1回投与した。

鉄過負荷 + Alnus incana グループの全抽出物鉄過負荷ラットに、Sajid et al.15 に従ってメタノール抽出物 (200 mg/kg 体重) を、胃管を使用して 1 日 1 回、1 か月間経口投与しました。

鉄過剰＋ブタノール画分グループ鉄過剰ラットに、胃管を使用してブタノール画分（100 mg/kg 体重）を 1 か月間 1 日 1 回経口投与しました。

鉄過剰＋参照薬（デフェロキサミン）群鉄過剰ラットに、Mirzaei et al.75 に従ってデフェロキサミン（50 mg/kg 体重）を腹腔内注射し、1 日 1 回、1 ヶ月間投与した。

2 か月後、眼窩後神経叢穿刺によってすべてのグループから血液サンプルを収集し、15 分間保持し、15 分間遠心分離して、生化学パラメーターの評価に使用する血清を分離しました。その後、ラットは頚椎脱臼により安楽死させられ、肝臓は生化学的アッセイのために保存されるか、さらなる組織病理学的調査のために10%中性緩衝ホルマリン(NBF)中で固定された。

血清アルブミン、総タンパク質、総ビリルビン、AST、および ALT 活性は、Biodiagnostics (エジプト、カイロ) から購入した市販のキットに従って評価しました。

血清鉄レベルは、エジプト、カイロの Spectrum Diagnostics から購入した市販のキットを使用して推定しました。肝組織の標本を冷リン酸緩衝生理食塩水中でホモジナイズし、その後 Wootton76 の記載に従ってホモジネート中の肝鉄含有量を測定しました。

肝ホモジネートを使用して、それぞれ Ohkawa et al.77、Ellman78、Bradford79 によって記載された方法に基づいて、MDA (脂質過酸化バイオマーカー)、GSH、および総タンパク質濃度を推定しました。

ドイツのCusabioから購入したELISAキットを使用して、肝臓ホモジネート中のカスパーゼ-3活性とTNF-αレベルをアッセイしました。

Bancroft と Gamble80 によって以前に報告されているように、肝組織標本は 10% NBF で固定され、アルコールとキシレンで処理され、パラフィンに包埋され、手動ミクロトームで 4 μm 厚の切片にスライスされ、ヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) で染色されました。。 Sheehan および Hrapchak81 に従って、プルシアンブルー染色を使用して鉄の沈着と分布を検出しました。染色された切片を検査し、オリンパスの固定カメラを使用して写真を撮影した。

肝臓病変のスコアリングはすべてのグループ (6 匹のラット/グループ) で盲検的に評価され、病理学的病変の重症度は次のように測定されました: なし (-、正常な構造)、軽度の変化 (+、< 25%)、中等度の変化 ( ++、25 ～ 50%）、重度の変化（+++、51 ～ 75%）、および非常に重度の変化（++++、> 75%）44。

画像解析のために、各グループの 5 つの異なるプルシアンブルー染色切片 (×100) を検査し、ImageJ プログラムを使用して、青色の色素沈着によって表されるプルシアンブルー染色された鉄沈着物の面積パーセンテージ (面積 %) を定量化しました。

すべての実験グループの肝臓サンプルを、カスパーゼ 3 および NF-κB 抗体を使用した免疫組織化学 (IHC) に供しました。パラフィン切片を接着スライド上に固定し、再水和し、加熱による抗原賦活化を行った後、洗浄し、カスパーゼ 3/CPP32 (活性型、Diagnostic BioSystems) および NFκB-p65 (Elabscience Biotechnology) に対する一次ポリクローナル抗体と希釈してインキュベートしました。 1:100で一晩洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼと2時間インキュベートしました。 2 回洗浄した後、ジアミノベンジジンキットを使用して免疫染色を行ったところ、茶色が陽性の免疫反応性を示しました。

得られた結果は、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表されました。統計分析には一元配置分散分析が使用され、その後に SPSS バージョン 21.0 を使用した Tukey 多重比較検定が続きました。 P 値 < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。相関係数は、Abdel-Daim et al.82 に従って線形回帰を使用して推定されました。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開記事に含まれています。

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科学技術イノベーション資金庁 (STDF) がエジプト知識銀行 (EKB) と協力して提供するオープンアクセス資金。この研究は、公的部門、商業部門、非営利部門の資金提供機関から特別な助成金を受けていません。

エジプト、カイロ、アル・アズハル大学女子薬学部生薬学・薬用植物学科

ファトマ・アボ・エルギート、シャザ・A・モハメド、アビール・テムラズ

エジプト、ギザのカイロ大学獣医学部細胞学および組織学部門

AEヤシンですが

国家麻薬管理研究機構、ドッキ、カイロ、エジプト

ワリド・ハムディ・エル・タンタウィ & サマ・ファシー・アーメド

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WHTは研究の構想を提案した。実験を計画した。統計分析を実行しました。 FAは植物化学的調査と植物化学的データの解釈と論文執筆を実施し、SAMは植物化学的調査と植物化学的データの解釈を実施し、SFAは調査と生化学的研究を実施し、ATはデータ分析と最終改訂を実施し、YNAEは病理組織学的、組織化学的、免疫組織化学的研究を実施し、原稿を執筆しました。すべての著者が原稿の最終版を読み、修正し、承認しました。

Noha AE Yasin への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

アボ・エルギート、F.、モハメド、SA、ヤシン、NAE 他。雄のアルビノラットにおける鉄過剰誘発肝毒性の改善におけるアルヌス・インカナ（L.）メンヒ抽出物の効果。 Sci Rep 13、7635 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-34480-6

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受信日: 2022 年 12 月 14 日

受理日: 2023 年 5 月 2 日

公開日: 2023 年 5 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34480-6

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