チベット豚の極限環境適応の腸内微生物叢の特徴 - 武漢バタフライエフェクト株式会社

npj Biofilms and Microbiomes volume 9、記事番号: 27 (2023) この記事を引用

656 アクセス

8 オルトメトリック

メトリクスの詳細

チベット豚（TP）は、自己ゲノムシグナルによってチベット高原の極限環境に適応することができますが、宿主の適応における腸内細菌叢の役割についてはほとんど知られていません。ここでは、高地および低地で飼育されているブタ（中国からの 87 頭（CP）とヨーロッパからの 200 頭（EP））から 1050 種レベルのゲノムビンにクラスター化された TP（n = 65）から 8210 個のメタゲノムで組み立てられたゲノムを再構成しました。 (SGB) 平均ヌクレオチド同一性 95% の閾値。 SGB の 73.47% が新種でした。 1,048頭のSGBに基づく腸内微生物群集構造分析では、TPが低地で飼育されたブタとは大きく異なることが示された。 TP 関連 SGB は、セルロース、ヘミセルロース、キチン、ペクチンなどの複数の複雑な多糖類を消化することができます。特に、TP では、短鎖および中鎖脂肪酸 (酢酸、ブタン酸、プロパン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸) の生産に関与するフィブロバクテロータ門とエルシミクロビア門が最も一般的に濃縮されていることがわかりました。乳酸、20 種類の必須アミノ酸、複数のビタミン B (B1、B2、B3、B5、B7、B9) および補因子の生合成に使用されます。予想外なことに、フィブロバクテロータだけが、酢酸、アラニン、ヒスチジン、アルギニン、トリプトファン、セリン、スレオニン、バリン、B2、B5、B9、ヘムおよびテトラヒドロ葉酸の合成を含む強力な代謝能力を示しました。これらの代謝産物は、エネルギーハーベスティングや低酸素や紫外線に対する耐性など、宿主の高地への適応に寄与している可能性があります。この研究は、哺乳類の高地適応において腸内マイクロバイオームが果たす役割を理解するための洞察を提供し、動物の健康を改善するためのプロバイオティクスとしての可能性のある微生物をいくつか発見しました。

チベット豚 (Sus scrofadomesticus) は青海チベット高原原産の在来種であり、低酸素、厳しい寒さ、強烈な紫外線 (UVR)、食糧不足などの長期にわたる高地の過酷な環境下でも生存することができます1。 2、3。したがって、チベット豚の高地適応メカニズムを理解することは、ストレス耐性に関与する新しい遺伝的要素を発見するために非常に重要です。ゲノム解析により、チベット野生イノシシにおいて、UVRに対するゲノム安定性の維持や低酸素下での分子適応など、高地への適応に関連する268個の遺伝子がポジティブセレクション下にあることが発見された4。より具体的には、この研究は、ヘモグロビンの合成を助け、酸素結合を強化する3つのビタミンB6結合遺伝子（ALB、SPTLC2、およびGLDC）と、4つの低酸素関連遺伝子（ALB、ECE1、GNG2、およびPIK3C2G）を同定した。さらなる研究により、肺血管緊張およびヘモグロビン濃度の表現型の変動に関連する PLA2G12A および EPAS1 遺伝子の遺伝子変異が発見されました5。最近、追加の研究では、腸内細菌叢が栄養代謝6,7、エネルギー調節8,9、宿主の健康維持のための免疫系の発達において重要な役割を果たしているため、チベット豚の高地適応の腸内細菌叢の特徴にも注目した10,11。例えば、16 S リボソームのメタ分析では、低地豚と比較してチベット豚に最も豊富な 3 つの腸内細菌、アシネトバクター、シュードモナス、およびスフィンゴバクテリウムが明らかになりました 12。高地のチベット豚から採取した 12 個の糞便サンプルのメタボロミクス分析では、プロパン酸とオクタデカン酸の生成が大幅に改善され、これら 2 つの代謝産物に関連する遺伝子も上方制御されていることが実証されました 12。つまり、これらの発見は、高地環境がチベット豚の独特の腸内微生物叢と機能的多様性を形成していることを示しました。しかし、これまでの研究ではサンプルサイズが小さく、メタゲノム配列の深さが浅かったため、チベット豚の腸内細菌叢の多様性と機能的景観、および宿主の高地適応の特徴については依然として不明である。

豚は世界の主要な家畜であり、世界の家畜生産の重要な要素となっています。しかし、過去数十年にわたる家畜生産の急速な増加は、豚流行性下痢ウイルスなどの感染症の出現と蔓延にもつながり、養豚産業に直接的に莫大な経済的損失をもたらしています13,14。これは、哺乳期および離乳後の感染症の治療と予防を目的とした豚生産における抗生物質投与の最も一般的な用途を推進します。抗生物質の使用は微生物耐性の増加と微生物の多様性の減少に寄与し 15,16 、同様に豚の健康にリスクをもたらす可能性があります。抗生物質の使用による副産物の影響を軽減するために、Blaser17 は、おそらくプレバイオティクスを併用して、重要な発生経路を調節する重要な欠落および/または絶滅した種や株をプロバイオティクスで置き換えることを推奨しました。家畜の野生の近縁種や在来種は、プロバイオティクスの探索にとって膨大な資源となる可能性があります。例えば、Rosshart ら 18 は、野生マウスの腸内マイクロバイオームを実験用マウスに最終的に移植すると、宿主の適応性が促進され、肺感染症や腫瘍形成の耐病性が向上する可能性があると報告しました。より強い耐病性を持つ在来種の豚の糞便微生物を市販の子豚に導入すると、早期の離乳ストレスによって引き起こされる下痢の再発を防ぐことができる可能性がある19。最近、13,000 を超える炭水化物分解遺伝子がチベット豚 (n=11) の腸内微生物叢で同定され、そのほとんどがファーミクテス門、バクテロイデス門、スピロヘトータ門、ヴェルコクロビオ門門、およびフィブロバクテロータ門の 5 つの門に分布していました 20。これらの研究は、チベット豚が豚の健康を改善する予期せぬプロバイオティック微生物を保有している可能性があることを示しました。しかし、これまでのところ、チベット豚の腸内微生物叢に関する全身的なゲノムレベルの研究はまだ不足しています。

今回我々は、平均海抜3500メートル以上の中国雲南省徳欽県に位置し、自由に放牧している47頭のチベット豚（TP）から採取した31個の糞便内容物サンプルと34個の盲腸内容物サンプルのディープメタゲノムシーケンスを実行した。我々は、287頭の低空飼育ブタ（中国CPから87頭、ヨーロッパEPから200頭）からの公開腸管メタゲノムを統合することにより、ブタの腸内微生物叢から1048種レベルのゲノムビン（SGB）を回収した。私たちは、CPとEPの両方と比較して、TPの腸内細菌叢の明確な多様性と機能プロファイルを発見しました。この結果は、チベット豚の高地適応を理解するための洞察を提供するだけでなく、プロバイオティクスとしてのTP関連腸内微生物叢の可能性も探求するでしょう。

779 Gb を超えるメタゲノム配列データが、65 の TP サンプルから Illumina HiSeq × Ten プラットフォームによって生成されました (補足表 1)。我々は、上記のシークエンシング生リードを、デンマーク、フランス、中国の 287 頭の捕獲ブタの公開されているメタゲノム配列データセットと統合し 21、ブタの腸ゲノムカタログを生成しました。単一サンプルのアセンブリ戦略を使用して、完全性 > 75%、汚染度 < 10% の品質閾値で合計 8,210 個の MAG を再構成しました 22,23 (「方法」を参照、図 1A)。これらの MAG のうち合計 3,807 個は、コンタミネーションが 5% 未満で完全性が 90% を超える高品質のゲノムでした (図 1B)。平均ヌクレオチド同一性 (ANI) 閾値 95%24 で複製を解除した後、さらなる分析のために 1,050 個の SGB が同定されました (「方法」を参照)。各サンプル中の SGB の存在を決定するために少なくとも 40% のゲノムカバレッジを使用し、最終的に 1,048 個の代表的な SGB が得られ、そのうち 623 個の SGB (59.45%) が高品質のゲノム (完全性 > 90%、コンタミネーション < 5%) でした。 (補足表 2)。各 SGB は平均 7.8 MAG によってサポートされており、SGB の 57.25% には少なくとも 2 つの MAG が含まれていました (補足表 2)。ゲノム分類データベースツールキット (GTDB-Tk)25 を使用して、SGB の分類学的割り当てを実行しました (「方法」を参照)。その結果、SGB は 20 の細菌門と 1 つの古細菌門に分類され、SGB の 90.74% が既知の属に割り当てられ、SGB の 73.47% が未分類種 (uSGB と命名) であることが示されました (図 1C)。さらに、1048個のSGBのうち45.04%がファーミクテスAに、25.86%がバクテロイデテスに、6.97%がファーミクテスに、5.63%がプロテオバクテリアに割り当てられた(補足表3)。 TP、EP、および CP における SGB の有病率と分類を図 1D に示します。これは、3 つのグループ間の門レベルでの微生物群集の違いを示しています。さらに、1048 個の SGB の機能遺伝子プロファイルが MetaGeneMark (v.3.38)26 を使用して予測されました (「方法」を参照)。すべての遺伝子アノテーションは、炭水化物活性酵素 (CAZymes) 27 および京都遺伝子およびゲノム百科事典 (KEGG) オルソロジー (KO) 28 データベースを使用して実行されました (「方法」を参照)。

A 中品質および高品質の MAG のプロファイル。中品質および高品質のゲノムのゲノムサイズ、N50、コンティグ数。異なる色でゲノム品質の違いを示します。関連するソースデータは、ソースデータファイルとして提供されます。 B ブタの腸メタゲノムから回収された 8,210 個のゲノムの完全性と汚染度の推定。ゲノムの品質は完全性 - 5 汚染としてスコア付けされ、75% を超える品質スコアを持つゲノムのみが保持されました。中品質のゲノムは緑色で示され、高品質のゲノムは赤色で示されます。 x 軸と y 軸に沿ったヒストグラムは、それぞれ完全性と汚染のさまざまなレベルでのゲノムの割合を示しています。関連するソースデータは、ソースデータファイルとして提供されます。 C 各分類ランクの SGB の数。 GTDB-Tk によって種レベルで既存の参照ゲノムを持たない SGB は未知の SGB (uSGB) として定義され、代わりに、少なくとも 1 つの参照ゲノムを持つ SGB は既知の SGB (kSGB) とみなされました。 D ブタ腸の代表的な SGB の系統樹。内側の円は、GTDB 門レベルの分類分類に従って色付けされた 1048 個の代表的な SGB の系統樹です (色の凡例を参照)。第 1 リングから第 3 リングまで外側に移動する同心円は、各グループ内の SGB の有無に応じてグループが濃縮された SGB を表します。 TPs は自由に放牧されているチベット豚、EPs は低空で飼育されているヨーロッパの豚、CPs は低空で飼育されている中国の豚を表しています。関連するソースデータは、ソースデータファイルとして提供されます。

Chen ら 29 は、500 頭の中国豚の腸内微生物叢データセットから 6,339 個の MAG (完全性 > 50%、汚染度 < 5%) と 2,673 個の SGB (ANI ≧ 95%) を特定しました。同定された SGB の独自性を調査するために、当社の 8210 MAG を Chen のデータセットと統合し、ANI ≧ 95% のしきい値で SGB を同定するために、MAG の完全性が 75% 以上、汚染度が 5% 未満に保たれました。最終的に合計 2266 個の SGB が取得されました。そのうち 1248 件（55.08%）はチェンの研究に固有のものであり、519 件（22.90%）はこの研究に固有のものであり、499 件（22.02%）は重複していました（補足図 1）。この発見は、ブタの腸内微生物の多様性を理解するには継続的な努力が必要であることを示しています。

4 つのグループ (TP、CP、EP - デンマーク、EP - フランス) の腸内微生物叢のアルファおよびベータ多様性分析は、SGB の有病率または存在量に基づいて実行されました (「方法」を参照)。結果は、種の豊富さ、シャノンおよびシンプソンの多様性指数が、他のグループと比較してTPsで有意に増加していることを実証しました（図2A、ウィルコクソン順位和検定、p < 0.001）。主座標分析 (PCoA) (加重 UniFrac 距離行列に基づく) およびノンメトリック多次元尺度法 (NMDS) プロット分析 (Jaccard 距離行列に基づく) は、TP が他のグループから明確に分離されていることを一貫して示しました (図 1)。 2B、補足図2A、B）。さらに、サンプルタイプ（糞便と盲腸）間の微生物の多様性の差は、宿主グループ間の違いよりも大幅に低く（補足図2C〜F）、TPが異なる腸内微生物叢を保有していることを示唆しています。例えば、すべての SGB の 14.12%、8.97%、および 1.43% が、それぞれ TP、EP、および CP に独自に存在していました (図 2C)。各サンプルの各SGBの有無に応じて、464個のSGBがTPと、209個のSGBがEPと、146個のSGBがCPと有意に関連していることがわかりました（補足表4、ウィルコクソン順位和検定、p < 0.05、FDR）修正しました）。門レベルでは、線維芽細胞症およびエルシミクロビアの有病率は、EPおよびCPよりもTPで有意に高かった(図2D;図2E、フィッシャー検定、p<0.001)。その代わりに、メタン生成における役割で知られるメタノバクテリオータ 30 は、他のグループに比べて TP では極めて有意に少なかった (フィッシャーの検定、p < 0.001)。 CP はメタノバクテリオータの有病率が最も高かった (フィッシャーの検定、p < 0.001)。 TP と CP は両方とも、EP よりも放線菌および疣贅菌の有病率が高かった (フィッシャーの検定、p < 0.01)。 Desulfobacterota および Planctomycetotah は主に CP に存在し (Fisher の検定、p < 0.001)、Deferribacterota および Verrucomicrobiota_A は EP に顕著に存在しました (Fisher の検定、p < 0.05)。

TP、EP、および CP 間の腸内マイクロバイオームのアルファ多様性指数の比較。バイオリンプロットとボックスプロットは、それぞれ種の豊富さ、シャノンとシンプソンの多様性指数を表します。各サンプル内の SGB の有無に基づく種の豊富さの棒グラフ、各サンプル内の SGB の相対存在量に基づくシャノンおよびシンプソンの多様性指数。色はホストグループを示します。関連するソースデータは、ソースデータファイルとして提供されます。 B TP、EP、CP 間のベータ多様性の比較。 PCoA は、サンプル間の重み付けされた UniFrac 距離行列に基づいていました。色と形状はそれぞれホストグループとサンプルの種類を示します。 EP および CP の微生物群集から分離された TP の微生物群集を示す PCoA プロット (変異ごとの多変量分散分析、p = 0.001、調整済み R2 = 0.44)。 B NMDS プロット分析は、サンプル間の Jaccard 距離行列に基づいていました。色と形状はそれぞれホストグループとサンプルの種類を示します。 NMDS プロットは、EP および CP から分離された TP の微生物群集を示しています (ストレス = 0.13)。関連するソースデータは、ソースデータファイルとして提供されます。 C TP、EP、および CP 間の SGB の分配。 TP、EP、CP における SGB の蔓延を示すベン図。色はサンプルグループを示します。 D TP、EP、および CP 間の門レベルでの微生物叢の分布。 TP、EP、および CP における門の蔓延を示す円グラフ。 E、TP、EP、および CP 間の門レベルでの濃縮分析の比較。特定の門における SGB の有病率に対応するバブルプロットの色とサイズ。ヒートマップは濃縮有意水準 (* は p > 0.05 を表す) を示し、色は濃縮グループを示します。

宿主群関連 SGB の炭水化物利用の可能性を調査するために、dbCAN231 を使用して CAZyme アノテーションを実行し、フィッシャーテストによる CAZyme の濃縮分析を実行しました (「方法」を参照)。その結果、TP関連SGBは飼育ブタ関連SGBよりもはるかに多くの炭水化物利用遺伝子をコードしており、遺伝子は主にグリコシドヒドロラーゼ（GH）ファミリー、炭水化物エステラーゼ（CE）ファミリー、および多糖リアーゼ（PL）ファミリーに属していることが実証されました（補足表）図５および図３、フィッシャーの検定、ｐ＜０．０５）。例えば、TP 関連 SGB には、CP および EP よりも GH43、CE12、GH105、GH88、GH35、および GH51 に多くの遺伝子が含まれていました (フィッシャーの検定、p < 0.001)。また、CE1、PL1、および GH53 には CP よりも多くの遺伝子が含まれ、EP よりも GH127 および GH146 に多くの遺伝子が含まれていました (フィッシャーの検定、p < 0.05)。 CAZy および dbCAN-PUL データベースに基づいて、GH43、CE12、GH105、GH35、および GH51 のすべての CAZyme が、セルロース、ペクチン、キチン、キシラン、その他のグルカンなどの植物多糖類の分解に関連していることがわかりました。 GH88 は、N-グリカンとグリコサミノグリカンの利用に関連しています。 CE1、PL1、GH53、GH127、および GH146 は、セルロース、ヘミセルロース、その他のベータグルカンなどの複数の多糖類の分解に関与します。これらの発見は、TP の腸内微生物叢が飼育ブタよりも大幅に強い多糖類利用能力を持っていることを示唆しています。

TP、EP、CP 間の CAZyme (グリコシルトランスフェラーゼを除く)、およびそれらに関連する潜在的な基質の有意な違いを示すヒートマップ。それは、前の宿主グループ内で著しく濃縮された CAZyme のみを示しています。

線維菌とエルシミクロビアは、他のグループではなく主に TP に存在していました (フィッシャーの検定、p < 0.001)。注目すべきことに、2 つの細菌門の SGB はすべて高品質であり、完全性は 90% を超え、汚染は 5% 未満でした (補足表 2)。したがって、KEGG経路の機能的可能性を解読するために、KOアノテーションとKEGG経路の濃縮分析を実行しました。結果は、線維菌のSGBに有意に濃縮された38のKEGG経路と、エルシミクロビアのSGBに39の経路がそれぞれ存在することを示した(補足表6、フィッシャー検定、p < 0.05、FDR補正)。全体として、2 つの門細菌は、それらの中で最も豊富な 10 の経路には両方とも翻訳、複製と修復、シグナル伝達、エネルギー代謝が含まれていたにもかかわらず、異なる代謝特性を示しました (図 4、フィッシャーの検定、p < 0.001)。線維菌は特に補因子やビタミンの代謝、アミノ酸の代謝に関与し、エルシミクロビアは主に糖鎖の生合成と代謝、さらには炭水化物の代謝に関与していました。さらに、アミノ酸代謝に関与する豊富な経路は、フィブロバクテロタ属とエルシミクロビア間で異なっていました（図4および補足表6、フィッシャー検定、p < 0.05、FDR補正）。たとえば、フィブロバクテロータは、バリン、ロイシン、イソロイシン生合成 (フィッシャーの検定、p = 0.002)、アラニン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸の代謝 (フィッシャーの検定、p = 0.010)、アルギニン生合成 (フィッシャーの検定、p = 0.014) の経路で有意に豊富でした。 )、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン生合成 (フィッシャーのテスト、p = 0.023)、リジン生合成 (フィッシャーのテスト、p = 0.025)、ヒスチジン代謝 (フィッシャーのテスト、p = 0.025)、システインおよびメチオニンの代謝 (フィッシャーのテスト、p = 0.032) ）。 Elusimicrobia はリジン生合成 (Fisher の検定、p = 0.0174)、およびグリシン、セリン、スレオニンの代謝 (Fisher の検定、p = 0.0277) を好みました。

Elusimicrobia および Fibrobacterota で大幅に濃縮された KEGG 経路を示すバブルプロット。濃縮有意性 (p 値) はフィッシャー検定で測定されました (「方法」を参照)。バブルの色は濃縮の重要性に反応し、バブルのサイズは特定の経路にマッピングされた遺伝子の数の比率に関係します。右側の代謝経路の同じ色は、同じ経路モジュールを示します。

代謝経路解析により、フィブロバクテレス属およびエルシミクロバイオータのSGBには、グルコース6-リン酸からピルビン酸へ、さらに短鎖-リン酸への変換を触媒する解糖経路（10遺伝子）およびピルビン酸代謝経路（2遺伝子）における一連の重要な酵素遺伝子が含まれていることが実証された。鎖脂肪酸（SCFA）、中鎖脂肪酸（MCFA）、乳酸塩、エタノールなど（図5、補足図3、補足表7）。さらに、それらは脂肪酸合成、アセチルCoAからマロニルCoAへの変換、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸の合成のための多数の酵素遺伝子をコードしていた。それにもかかわらず、フィブロバクテレスのSGBは、乳酸、ブタン酸、エタノールおよびプロパン酸の合成経路を除き、エルシ微生物叢よりもこれらの経路においてより多くの酵素遺伝子をコードしていた。 2つの門のSGBが、特定の触媒プロセスに関与するいくつかの独特の酵素遺伝子をコードしていたことは注目に値する。たとえば、フィブロバクテレス属の SGB は、2 つの経路を通じて酢酸合成にのみ関与していました。 1 つはピルビン酸を直接酢酸に変換する方法です。もう1つは、ピルビン酸をアセチルアデニレートに変換し、次に酢酸に変換したものです。 Elusimicrobiota の SGB は、ピルビン酸から乳酸への直接変換に関与しているだけです。確かに、ブタン酸合成など、一部の経路では 2 つの門の相互協力が必要になる場合があります。重要な酵素であるトランス-2-エノイル-CoA レダクターゼ [EC:1.3.1.44] と酪酸キナーゼ [EC:2.7.2.7] は、それぞれフィブロバクテレスとエルシミクロバイオータの SGB から注釈が付けられました。

Elusimicrobia と Fibrobacterota は、多糖類の分解、膜輸送、解糖、TCA サイクルに加え、脂肪酸、アミノ酸、ビタミン B および補因子の同化作用にも関与しています。 DHAP ジヒドロキシアセトンリン酸、GAP グリセルアルデヒド 3-リン酸、PRPP 5-ホスホリボシル二リン酸、3PG 3-ホスホグリセレート、PEP ホスホエノールピルビン酸、AIR アミノイミダゾールリボヌクレオチド、IMP イノシン一リン酸、GTP グアノシン 5'-三リン酸、D-Ru5P d-ribulオース 5-リン酸、 FAD フラビンアデニンジヌクレオチド、FMN リボフラビン-5-リン酸、DHF 7,8-ジヒドロ葉酸、THF テトラヒドロ葉酸、AL (S)-2-アセト乳酸、OIV 2-オキソイソ吉草酸、NAD+ ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、NADP+ ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸。

さらに、ペントースリン酸経路の非酸化的分岐のプロセスを触媒する豊富な酵素遺伝子が、フィブロバクテレスおよびエルシミクロバイオータのSGBによってコードされていました（補足図3）。たとえば、トランスケトラーゼ [EC:2.2.1.1]、リブロースリン酸 3-エピメラーゼ [EC:5.1.3.1]、リボース 5-リン酸イソメラーゼ A [EC:5.3.1.6]、およびリボースリン酸ピロホスホキナーゼ [EC:2.7. 6.1]は、フルクトース 6-リン酸からエリスロース 4-リン酸 (エリスロース-4P) および 5-ホスホ-アルファ-D-リボース 1-二リン酸 (PRPP) への変換を触媒します。エリスロース-4P はシキミ酸経路によるコリスミ酸合成の必須基質であることが知られています。コリスミ酸は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンの生合成の前駆体として機能します。 PRPP は、ヒスチジン合成と、ビタミン B1、B2、B9、フラビンアデニンジヌクレオチド (FAD)、フラビンモノヌクレオチド (FMN) の生合成に使用されるアミノイミダゾールリボヌクレオチド (AIR) およびグアノシン三リン酸 (GTP) の形成の重要な前駆体です。）およびテトラヒドロ葉酸（THF）。

フィブロバクテレス属とエルシミクロバイオータの代謝経路の濃縮分析により、2つの門が両方とも20種類の必須アミノ酸の合成に関与していることが示されました（図5、補足図4および補足表7）。フィブロバクテレスの SGB は、エルシミクロバイオータの SGB よりも多くの関連酵素遺伝子をコードしていました。例えば、フィブロバクテレス属のSGBには、PRPPを触媒してヒスチジンを生成する（9遺伝子）、オキサロ酢酸からグルタミン酸、さらにアルギニンを生成する（11遺伝子）、オキサロ酢酸からアスパラギン酸（1遺伝子）、アスパラギン酸からリジンを生成する（7遺伝子）という重要な酵素遺伝子がすべて含まれていた。遺伝子）、スレオニン（5 遺伝子）、グリシン（7 遺伝子）、3-ホスホグリセリン酸からセリン（3 遺伝子）、ピルビン酸からアラニン（2 遺伝子）およびバリン（5 遺伝子）、エリスロース-4P からコリスミ酸、およびさらにトリプトファン (12 遺伝子) まで。その結果、フィブロバクテレス属はエルシミクロバイオータよりもアミノ酸を合成する能力が強いことが示されました。 Elusimicrobiota の SGB は、リジン合成経路における 7 つの主要な酵素遺伝子 (7 遺伝子) をすべてコードしており、すべての主要な酵素遺伝子は、スレオニン 3-デヒドロゲナーゼ [EC:1.1.1.103] など、スレオニンからグリシンへ、さらにセリンへの変換を触媒しました。

さらに、フィブロバクテレス属とエルシミクロビオータのSGBには、ピリドキシンとコバラミンを除くビタミンBとその活性型の合成経路に複数の酵素遺伝子が含まれていました（補足図4）。たとえば、2 つの細菌門の SGB には、チアミンの合成経路に 10 個の遺伝子、ナイアシン、ニコチンアミド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NAD+) に 13 個の遺伝子、パントテネートと補酵素 A (CoA) に 11 個の遺伝子、ビオチンに 13 個の遺伝子が含まれていました。ヘムには19個の遺伝子も含まれます。注目すべきことに、フィブロバクテレス属はGTPを触媒してリボフラビン（7遺伝子）、葉酸、THF（12遺伝子）を生成するための必須酵素遺伝子をすべて持っており、ビタミンB群合成におけるそれらの重要な役割を示している。 Elusimicrobiota の SGB には、ナイアシンおよびニコチンアミド合成におけるより多くの酵素遺伝子が含まれていました。

この研究では、さまざまな豚品種から 8,210 個の MAG を回収し、それを 1,050 個の SGB にクラスター化しました。少なくとも 73.47% の SGB は新規の未確認の細菌種に属していました。ブタのマイクロバイオームの最大のデータセット 29 と比較すると、この研究には依然として 519 個の固有の SGB がありました。これらの発見は、この研究が既知の種のレパートリーを拡大し、ブタの腸内微生物叢の既知の系統学的多様性を拡張できることを示唆しています。さらに、TP は CP や EP よりも微生物の多様性が高く、これはチベットのアカゲザルが低地の近縁種よりも腸内微生物の多様性が高いという発見と一致しました 32。しかしながら、Zeng et al.14 は、チベット豚とチベット人の微生物の多様性が、低地の近縁種に比べて少ないことを発見した。 Worthmann ら 33 は、寒冷曝露によりマウスの濃厚さが低下し、シャノン多様性指数が低下すると報告しました。高地がチベット動物の腸内微生物の多様性の形成を促進するかどうかは、さらに解明する必要がある。さらに、サンプルタイプ間のベータ多様性の差（糞便対盲腸内容物）は、宿主群間のベータ多様性の差よりも有意に低いことがわかりました。これは、ヒトの腸に沿った部位間の微生物の多様性の差が個体間の変動よりも小さいという以前の発見と一致していました34。

私たちの以前の研究は、ヤクとチベットヒツジの宿主のエネルギー収集持続性のためのルーメンマイクロバイオームの収束進化を実証し、腸内マイクロバイオームによって媒介されるエネルギー恒常性が哺乳類の高姿勢適応に不可欠である可能性があることを示しました。この研究では、TP 関連微生物ゲノム中の多糖類、セルロースやその他のベータグルカン、ヘミセルロース、キチン、ペクチンを分解する可能性のある大量の酵素遺伝子を特定しました。これは、腸内微生物叢がTP は、低地の近縁種に比べて豊富な炭水化物分解酵素遺伝子をコードしていた 20。さらに、我々は、TP の腸内に線維菌症とエルシミクロビアが非常に多く蔓延していることを発見しました。それらは酪酸塩、酢酸、プロピオン酸塩、エタノール、乳酸塩などのエネルギー生成に関与していました。酪酸塩は結腸上皮細胞に吸収されて、腸壁バリアの完全性を維持し、腸細胞の炎症を防ぐことができます 36。酢酸とプロピオン酸は血流に吸収され、肝臓に移動して組織のエネルギー代謝を促進しました37。 Zheng ら 38 は、Elusimicrobia がグルコースを利用して乳酸と酢酸に発酵できることを実証しましたが、これは我々の発見と一致しています。したがって、我々は、TP に宿る独特の腸内細菌叢が高繊維食の利用を改善し、宿主が高地の極限環境に適応するためのエネルギー代謝を促進する可能性があると推測した。

高地の低酸素と紫外線は、青海チベット高原の典型的な特徴です2。重度の酸素欠乏は、肺損傷 39、心血管疾患 40、脳損傷疾患 41 の発生率を高める可能性があります。高い UVR にさらされると、皮膚の早期老化や、環境に影響された他の多くの皮膚疾患が引き起こされるためです42。この研究では、乳酸、アミノ酸（すなわち、ヒスチジンとアルギニン）、およびビタミン/補因子（すなわち、B2、B3、B9、THF、およびヘム）の生成における線維菌とエルシミクロビアの機能的可能性を発見しました（図5）、補足図3および補足図4）は、低酸素症およびUVR損傷に対する耐性と関連していました。例えば、乳酸は、NDRG3 タンパク質に結合して血管新生と細胞増殖を促進することにより、低酸素誘導因子 (HIF) とは独立した低酸素応答のプロモーターとみなされました 43。アルギニンは、血流と酸素供給を促進する天然の血管拡張剤とみなされている一酸化窒素 (NO) の前駆体です 44。ヒスチジンはヒスタミンに変換され、血流と毛細血管透過性の増加において特に重要な役割を果たすことができます45。また、UVR によってトランスウレタンに変換され、さらにシスウレタンに変換されて皮膚を保護することもできます46。リボフラビンとその補因子は、血球を健康に維持し、皮膚の健康を保護し、若年成人の低酸素耐久性を改善するのに有益でした47,48。葉酸とTHFは、低酸素誘発炎症の抑制49、赤血球の形成、皮膚保護のためのメラニンの生成において重要な役割を果たしました50。ニコチンアミドとナイアシンは肺組織の損傷の予防に関与しており 51、NAD+ は健康寿命と寿命の両方の延長に関与しています 52。ヘムは、酸素感知、酸素移動、電子移動に不可欠なヘモグロビンの重要な前駆体です53,54。これらの発見は、腸内微生物叢と高地低酸素および UVR に対する宿主の適応との間に予想外の関連性があることを示しました。

私たちの研究は、哺乳類の高地適応における腸内マイクロバイオームの役割を理解するための洞察を提供し、高地と大きく関連するフィブロバクテロータやエルシミクロビアのメンバーなど、将来のプロバイオティクスの探索のためのいくつかの候補微生物を示しています。哺乳類であり、青海チベット高原の非常に過酷な環境への宿主の適応に潜在的に貢献している可能性があります。しかし、チベット豚とその低地近縁種の腸内微生物叢の多様性に対する、さまざまなライフスタイルの影響を完全に解明することはまだできていません。将来的には、管理された実験下で培養腸内細菌が定着した無菌動物モデルを使用して、腸内マイクロバイオームと宿主の形質との間の発見された関連性を確認する必要がある。

すべての動物実験は、雲南大学動物実験倫理委員会によって承認されました。

中国雲南省徳欽県の海抜 3500 m で自由に放牧している 47 頭のチベット豚 (メスとオス) から、新鮮な盲腸内容サンプル (n = 34) と糞便サンプル (n = 31) を滅菌採取管に採取しました。補足表 1)。すべてのサンプルはドライアイスで直ちに凍結され、使用するまで -80 °C で保管されました。

DNA抽出は、QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen、Hilden、Germany)を製造業者の指示に従って使用し、機械的破壊および酢酸アンモニウム沈殿タンパク質の追加のステップを加えて実施した。 DNA の濃度と純度は、NanoDrop (Thermo Fisher Scientific Inc.、米国デラウェア州ウィルミントン) およびアガロースゲル電気泳動を使用して測定しました。メタゲノムライブラリーの調製は、製造元 (Illumina、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) の指示に従って、各サンプルの挿入サイズが 300 塩基対 (bp) の 1 つの DNA ペアエンドライブラリーで行われました。サンプルは、150 bp PE シーケンス戦略を採用した Illumina HiSeq × 10 プラットフォームでシーケンスされました。

私たちは、Xiao らから公開されているメタゲノムデータセットを収集しました。 Study21、合計 1758 Gb の高品質リードが欧州ヌクレオチドアーカイブ (ENA) にアクセッションコード PRJEB11755 で寄託されました。シーケンスの生リードは、287 頭の低地で飼育されたブタ (フランスのブタ 100 頭、デンマークのブタ 100 頭、中国のブタ 87 頭) から生成され、サンプルあたり平均 6.13 Gb でした。これらのデータセットは、さらなるメタゲノムアセンブリのために生のリードと統合されました。

当社の生のリードと公開されているリードをフィルタリングして、次のような低品質の配列を除去しました。(1) 品質スコアが 32 bp 未満の 40% 以上の連続塩基。 (2) N 塩基が 10% 以上。その後、Trimmomatic を使用して低品質のリードアダプターと低品質のリードをフィルタリングすることで、リードの品質をさらに管理しました55。 352 個の標本について合計 2.3Tb の高品質クリーンリードを取得し、標本あたり平均 6.6Gb でした。 MEGAHIT (v1.0)56 を使用して、各サンプルのすべてのクリーンリードを個別にアセンブルしました。長さが 500 bp を超えるコンティグは、BWA(v.0.7.12)57 を使用してリードにアラインメントされました。次に、Samtools (v.1.9)58 および Bedtools (v.2.27.1)59 を使用して、コンティグの範囲と深さを計算しました。 MetaBAT260 を実行して、コンティグのテトラヌクレオチド頻度と存在量 (または平均深さ) に基づいて、組み立てられたコンティグを各サンプル内の推定ゲノム (MAG) にビン分けしました。続いて、CheckM (v.1.0.7)61 を使用して、系統特異的マーカー遺伝子とデフォルトパラメーターによる MAG の完全性と汚染を推定しました。一般に、完全性 > 50%、汚染度 < 10% の回収 MAG は中品質または高品質とみなされます 62,63,64 が、我々は完全性 > 75%、汚染度 < 10% として中品質のより厳密なしきい値を設定しました 22,23 。完全性 > 75%、汚染度 < 10% の MAG は、さらなる改良と検証のために保持されました。 RefineM (v.0.0.14)22 を使用して、デフォルトのパラメーターを使用して、異なるゲノム特性、一致しない分類学的分類、および一致しない 16 S rRNA 遺伝子を含むビンをフィルター処理しました。 CheckM (v.1.0.7) を再実行して、保持された MAG のゲノム品質を評価しました。 8210 個の高～中品質の MAG (完全性 75%、汚染 10%) が得られました。次に、デフォルトパラメーター Mash66 および ANIs67 (しきい値 95%) を備えた dRep (v.2.6.2)65 を使用して、これらの MAG を種レベルのゲノムにクラスター化しました。各クラスター内の最大のゲノム品質スコア (完全性 - 5X 汚染 + 0.5logN50) を持つゲノムが、代表的な SGB として選択されました。サンプル内のカバー率が 40% を超える SGB がこのサンプルに存在すると判断されました。したがって、この研究では、ブタ腸内の合計 1,048 個の代表的な SGB が最終的に再構築されました (補足表 2)。

GTDB-Tk (v.1.4.0)25 を使用して、GTDB (リリース 95) に基づいて 1048 の代表的な SGB の分類学的割り当てを実行しました (補足表 3)。 SGB の系統樹は FastTree (v.2.1.10)68 によって構築され、iTOL (v.6.6)69 を使用して視覚化されました。

各 SGB のオープンリーディングフレーム (ORF) は MetaGeneMark (v.3.38)26 を使用して予測されました。すべての ORF を KEGG 遺伝子データベース (v.96) にマッピングして KO に注釈を付け、dbCAN231 を使用して CAZy データベースに位置合わせして CAZyme に注釈を付けました。 CAZyme 含有遺伝子の炭水化物基質は、dbCAN-PUL データベースを使用して取得されました。

種の豊富さは、Vegan パッケージによる各サンプル内の各 SGB の有無に基づいて計算されました (ソースデータファイルを参照)。シャノンおよびシンプソンの多様性指数は、Vegan パッケージによる各サンプル内の各 SGB の存在量に基づいて計算されました (ソースデータファイルを参照)。各 SGB の存在量または深さは、ゲノムにマッピングされた塩基の全長をゲノムサイズで割った式に基づいて計算されました。 4 つのグループ間のアルファ多様性の統計的差異は、Wilcoxon 順位和検定を使用して測定されました。 PCoA プロット分析は、Phyloseq パッケージを使用して、サンプル間の加重 UniFrac 距離行列に基づいて実行されました。 NMDS プロット解析は、Vegan パッケージを使用して、サンプル間の Jaccard 距離行列に基づいて実行されました。各グループの各 SGB の濃縮分析は、各サンプル中の SGB の有無に基づいて測定されました。 3 つのグループ間の各 SGB 濃縮における統計的差異は、Wilcoxon 順位和検定によって分析されました。各グループの濃縮された SGB には注釈が付けられた CAZyme が付けられ、各グループの注釈が付けられた CAZyme の数に応じて、フィッシャーの直接確率検定を使用して濃縮分析を実行しました。フィブロバクター門およびエルシミクロバイオータのすべての SGB は、注釈付きの KO に割り当てられました。フィッシャーの直接確率検定を使用して、特定の経路の総 KO 数に対する注釈付き KO 数の比率に基づいて、各門の KEGG 経路の濃縮度を分析しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

生の配列データと MAG プロファイルは、中国国家遺伝子バンクデータベース (CNGBdb) の CNGB 配列アーカイブ (CNSA) にアクセッション番号 CNP0003325 で寄託されています。 https://db.cngb.org/qtp/ でも入手できます。図の基礎となるソースデータは次のとおりです。図 1 ～ 2 および補足図 1 ～ 2 は、ソースデータファイルとして提供されます。

データ分析を実行するために使用されるコードの詳細情報は、補足資料で入手できます。

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リファレンスをダウンロードする

この研究は、第 2 回チベット高原科学遠征および研究 (STEP) プログラム (NO. 2019QZKK0503)、中国国立自然科学財団 (NO. U2002206 および 31970571)、中国雲南省の主要科学技術プロジェクト (NO) によって支援されました。 . 202001BB050001)、中国科学院の重点研究プログラム (NO. KFZDSW-219)、および雲南大学大学院研究イノベーションプロジェクト (NO. KC-22221159)。

Fangfang Zhao、Lili Yang、Tao Zhang の著者も同様に貢献しました。

雲南省生物資源の保存と利用のための国家重点実験室、雲南大学生命科学部、昆明、雲南、650091、中国

Fangfang Zhao、Tao Zhang、Daohua Zhuang、Qunfu Wu、Jiangkun Yu、Chen Tian、Zhigang Zhang

甘粛農業大学動物科学技術学部、甘粛省草食動物バイオテクノロジーの主要研究室、蘭州市、甘粛省、730070、中国

趙方方

遺伝資源と進化の国家重点研究所、進化および機能ゲノミクス研究所、中国科学院昆明動物研究所、昆明、雲南、650201、中国

リリ・ヤン、Qunfu Wu、Zhigang Zhang

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ZGZ が研究を考案し、設計しました。 DHZ、FFZ、CT、LLY、TZ の分析データ。 QFW はサンプル収集に貢献しました。 JKY がメソッドに貢献しました。 FFZとZGZが原稿を書きました。 ZGZは原稿を修正しました。すべての著者は、提出前に最終版を読んで承認しました。

Zhigang Zhang への通信。

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転載と許可

Zhao、F.、Yang、L.、Zhang、T. 他。チベット豚の極限環境適応の腸内微生物叢の特徴。 npj バイオフィルムマイクロバイオーム 9、27 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41522-023-00395-3

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受信日: 2022 年 8 月 9 日

受理日: 2023 年 5 月 10 日

公開日: 2023 年 5 月 24 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00395-3

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