染色体 - 武漢バタフライエフェクト株式会社

園芸研究第 8 巻、記事番号: 129 (2021) この記事を引用

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ステビア (Stevia rebaudiana Bertoni) は、一般的な四環系ジテルペノイドステビオール主鎖と可変グリコンからなる非常に甘いステビオールグリコシド (SG) でよく知られています。ステビオール配糖体はスクロースより 150 ～ 300 倍甘く、天然のゼロカロリー甘味料として使用されます。ただし、最も有望な化合物は少量で生合成されます。 Illumina、PacBio、および Hi-C シーケンスに基づいて、616.85 kb のコンティグ N50 値および 106.55 Mb のスキャフォールド N50 値を含む 1416 Mb をカバーするステビアの染色体レベルのアセンブリを構築しました。ステビアゲノムの 5 分の 4 以上が反復要素で構成されていました。私たちは、高品質のゲノム内の 44,143 個の信頼性の高いタンパク質コード遺伝子に注釈を付けました。ゲノム進化分析により、ステビアとヒマワリは約 2,940 万年前 (Mya)、共通の祖先に発生した全ゲノム重複 (WGD) イベント (WGD-2、約 3,210 万年) の直後に分岐したことが示唆されました。比較ゲノム分析により、ステビアで拡張された遺伝子は主に特殊な代謝産物の生合成、特にテルペノイド骨格の生合成、およびこれらの化合物のさらなる酸化とグリコシル化のために豊富であることが明らかになりました。さらに、SG生合成に関与するすべての候補遺伝子を同定しました。総合すると、ステビア参照ゲノムに関する現在の発見は、ステビアの進化の歴史を詳しく分析し、将来の育種プログラムで SG 生合成やその他の重要な農業形質に寄与する新規遺伝子を発見するのに非常に役立ちます。

糖分の多い食事は、肥満や糖尿病などの重篤な健康問題を引き起こすことが知られています1。一部の国では、高カロリーの砂糖の消費を減らすために砂糖税を課しています。これは、カロリーゼロの甘味料への代替を奨励することで砂糖の消費を減らすために推奨される戦略です2。ステビアの葉から抽出されたステビオール配糖体はカロリーを含まず、望ましい自然な甘味を持っています3。ステビアレバウディアナ (2n = 22) はパラグアイ原産の甘いハーブで、その葉抽出物は南米で何世紀にもわたって天然甘味料として使用されてきました4。甘味に加えて、SG の 2 つの豊富な成分であるステビオシドとレバウジオシド A (Reb A) も、動物モデルにおいて TRPM5 チャネル活性を増強することでインスリン分泌を直接増強できるため、2 型糖尿病に治療効果をもたらす可能性があります 5,6。ステビアは、天然甘味料および伝統薬として使用するために、アジア、北アメリカ、ヨーロッパで広く栽培されています。

ステビア属は、キク科の Eupatorieae 族に属します。ステビア属の約 230 種の中で、S. rebaudiana は SG を含む唯一の種です 3,7。 SG は、C-13 および C-19 の位置で異なるグリコシル化パターンで修飾されたコアのジテルペノイドステビオールバックボーン (アグリコン) を持っています 3,8。これらのジテルペノイド配糖体はほぼステビアの葉にのみ存在し、乾燥重量の最大 20% を占めます 9,10。ステビオシドと Reb A が SG の 2 つの主成分であり、次に Reb C、Reb F、ズルコシド A、Reb D、および Reb M が続きます。標識実験により、SG の主鎖は 5 炭素イソプレノイド単位から生合成されることが明らかになりました。主にメチルエリスリトールリン酸（MEP）経路に由来します11。 SG とジベレリン酸 (GA) の生合成経路は 4 つのステップを共有しており、これら 2 つのラブデン型ジテルペノイドの最後の共通基質は ent-カウレン酸 12、13、14 です。 SG 生合成経路では、ent-カウレン酸ヒドロキシラーゼ (ent-KAH) が ent-カウレン酸の 13-ヒドロキシル化を触媒して、すべての SG の骨格として機能する ent-13-ヒドロキシカウレン酸 (ステビオール) を形成します。次に、一連のサイトゾル UDP 依存性糖転移酵素 (UGT) によって触媒されるアグリコン (ステビオール) の一連のグリコシル化プロセスにより、さまざまな種類の SG が生成されます。グルコースはすべての SG の主要な糖部分ですが、ラムノースとキシロースは Reb C やダルコシド A3 などの少数の SG にのみ存在します。

ステビアは、ジテルペノイドの二次代謝産物であり、GA と同様の初期生合成ステップを有する SG の蓄積において独特です。 GA は正常な植物の成長と発育に不可欠であり、GA 生合成経路に関与する遺伝子は高等植物では保存され、厳密に制御されています 16,17。 GA の正常な代謝を妨げないように、SG と GA の生合成は空間的または時間的に分離する必要があると思われます 12。しかし、ステビアにおける SG 蓄積の進化と SG と GA 生合成の分離機構は依然として解明されていません。コアの四環系ジテルペン (GA12 およびステビオール) の形成後、酸化とグリコシル化が行われて、最終的な生理活性化合物、それぞれ GA と SG が生成されます。 GA 生合成に関与するオキシダーゼ遺伝子とは異なり、ジテルペノイドのグリコシル化に関与する UGT 遺伝子はほとんど記録されていません 18,19。ステビアは、葉に 30 種類以上の SG が蓄積するだけでなく、成長サイクルが短く、繁殖が容易であるため、ジテルペノイドのグリコシル化の研究に理想的な植物モデルです。ステビアのゲノム配列が存在しないため、SG のグリコシル化に関与する UGT 遺伝子を同定する研究のほとんどは、発現配列タグまたはトランスクリプトーム配列に基づいており、これまでのところ SG の生合成に寄与することが特徴づけられている UGT は 3 つだけです 20,21 。この欠損は SG 生合成の研究を妨げ、その結果、キク科におけるステビアの進化の包括的な理解を妨げてきました。

本研究では、PacBio シークエンシングと Hi-C アプローチを組み合わせて、ステビア (品種「Zhongshan No. 7」) の高品質参照ゲノム配列を生成しました。このゲノム配列に基づいて、キク科ステビアの進化解析を行いました。さらに、SG生合成に関与する候補遺伝子セットが同定されました。この参照ゲノムは、将来の SG 生合成の進化的理解とステビアの品質向上に非常に役立ちます。

中国のステビア品種「中山 No. 7」の葉を、デノボゲノム配列決定およびアセンブリのために収集しました。 K-mer分析に基づいて、ステビアのゲノムサイズは1.16 Gb、ヘテロ接合率は0.43％、リピート数は73.13％と推定されました（補足表1および補足図1）。高い反復配列を持つこの複雑なゲノムを正確に組み立てるために、ショートリードの Illumina シーケンシング、ロングリードの PacBio シーケンシング、および Hi-C シーケンスのアプローチを組み合わせて使用しました。 114.96 Gb の PacBio シーケンシングサブリードを取得し、ステビアゲノムを約 99.5 倍カバーしています (補足表 2)。これらのサブリードは、6978 コンティグを含む 1405 Mb ゲノムに組み立てられ、コンティグ N50 値は 616.85 kb で、最長コンティグの長さは 26.27 Mb でした (補足表 3)。合計 76.86 Gb の Hi-C クリーンデータが生成され、そのうち 90.42% のリードが組み立てられたコンティグにマッピングされました (補足表 4)。 Hi-C データの指導の下、我々は 6,358 個のコンティグを 11 個の偽染色体にクラスター化し、階層的クラスタリング戦略に従ってアセンブリの 91.28% の方向を指定することに成功しました 22 (補足表 5 および補足図 2)。最終的な染色体レベルのステビアアセンブリは、長さが 1416 Mb、N50 足場サイズが 106.55 Mb でした (表 1)。

ステビアゲノムアセンブリの完全性を評価するために、3 つのデータソースを組み合わせて使用しました。まず、イルミナのデータを組み立てられたゲノムに合わせて調整し、クリーンリードの 98.14% がマッピングされました (補足表 6)。 458 個のコア真核生物遺伝子 (CEG) のうち合計 451 個が、現在のステビアゲノムアセンブリで同定されました (補足表 7)。さらに、BUSCO23 分析により、完全な BUSCO の 86.04% がステビア集合体に存在することが明らかになりました (補足表 8)。これらすべての発見は、組み立てられたステビアゲノムが高い完全性と正確性を持っていることを示唆しています。

我々は、相同性に基づく方法とコンピュータでの予測を通じてステビアゲノムの反復要素に注釈を付けたところ、アセンブリの 80.11% が反復要素で構成されていることが判明しました。そのうち、レトロトランスポゾンが 69.45%、DNA トランスポゾンが 5.83% を占めました。ステビアゲノムの 65% 以上は長末端反復レトロトランスポゾン (LTR-RT) で構成され、その 32.30% はコピア系統に属し、66.76% はジプシー系統に属していました (補足表 9)。 LTR-RT は Helianthus annuus (ヒマワリ)24、Lactuca sativa (レタス)25、そしてキクナンキンセ26．タンパク質をコードする遺伝子のアノテーションについては、相同性ベースの予測方法、ab initio 予測方法、および RNA Seq 支援予測方法の 3 つの方法を組み合わせて使用しました。最後に、我々の現在のステビアアセンブリでは、44,143 個のタンパク質コード遺伝子が予測され、平均遺伝子長は 3493 bp でした (表 1)。トランスクリプトーム分析の結果、37,489 個の予測遺伝子 (84.93%) が 7 つの器官 (5 つの異なる発育段階の根、茎、葉) のうちの少なくとも 1 つによってサポートされていることが示されました。全体として、41,801個のタンパク質コード遺伝子（94.69％）は、5つのデータベース（NR、TrEMBL、KOG、KEGG、およびGO）のうちの少なくとも1つで機能が割り当てられ（補足表10）、40,355個は11個の偽染色体に固定されていました。図1b〜eは、各偽染色体のコピア密度、ジプシー密度、遺伝子密度、および転写レベルを示しています。

a 擬似分子 (Mb) の円形表現。 b Copia LTR-RT の密度。 c ジプシー LTR-RT の密度。 d 遺伝子密度。 e 平均転写レベル、log2(RPKM)。 f GC コンテンツ。 g ステビア擬似分子全体にわたるシンテニックブロック。 100 万リードあたりの kb あたりの RPKM リード数

ステビアと他のキク科植物との進化的関係を理解するために、Vitis vinifera、Solanum lycopersicum、Daucus carota、および 5 つのキク科植物 (L. sativa、C. nankingense、Artemisia annua、H. annuus、S) を使用して比較ゲノム解析を実行しました。 .レバウディアナ）。これら8種で同定された799個のシングルコピーオーソロガス遺伝子に基づく系統解析により、ステビアとヒマワリ（ヒマワリ科連合）との密接な関係、およびC. nankingenseとA. annua（ヒマワリ科）との密接な関係が確認されました（図2a）。ステビアとヒマワリの推定分岐時期は約 2,800 ～ 3,100 万年前 (Mya) です。ステビアとヒマワリの最新の共通祖先 (MRCA) は、約 37 ～ 3800 万年前に C. nankingense と A. annua の MRCA から分岐しました。これは Song らの発見と一致しています 26。ステビアと C. nankingense の MRCA は、約 3,900 万年から 4,000 万年前にレタスから分岐しました (図 2a)。

799 個の単一コピーオーソロガス遺伝子に基づくステビアと他の 7 つの植物の系統樹。 b Ks 分布。左の y 軸、ステビア - ヒマワリオーソログ (青)、ステビア - レタスオーソログ (オレンジ)。右の y 軸、ステビアパラローグ (緑色)、ヒマワリパラローグ (濃い緑色)、レタスパラローグ (紫)。 c ステビア、レタス、ヒマワリのシンテニーブロック

WGD は植物の遺伝的、生化学的、進化的新規性の重要な源と考えられているため、ステビアの進化における全ゲノム重複 (WGD) 事象をさらに調査しました 27,28,29。我々は、MCScanX パッケージ 30 を使用して、予測されたステビア遺伝子の 20.69% を占める 5,209 個のパラロガス遺伝子ペアを同定しました。これらの重複遺伝子ペアの Ks 分布は 0.53 でピークに達し、約 3,210 万年前の WGD イベントの発生を反映しています (図 2b)。ステビアとヒマワリの間のオルソロガス遺伝子対の Ks 分布に基づいて、それらの分岐時間が約 2,940 万年であると推定されました。これは、それらの共通祖先が経験した WGD イベント (WGD-2) の直後に分岐したことを示しています。相同遺伝子対の Ks 分布は、全ゲノムの三重化 (WGT-1、約 4,550 万〜5,150 万年) がレタスで起こったことを明確に示しました (図 2b)。これは、ほとんどのキク科の祖先でも起こったと考えられています 24,25。 26、31。この分析により、ステビアは、ヒマワリと共有された最近の WGD-2、キク科の基底 WGT-1、およびすべての真正双子葉類で発生した祖先の古六倍性現象 (WGT-γ) を特徴とする複雑な進化の歴史を経験したことが示されました 32。したがって、キク科のMRCA（WGT-1後）の祖先領域については、現在、レタスゲノムと比較してステビアゲノムとヒマワリゲノムに2つの遺伝領域が存在すると予想されています（図2c）。ステビアとヒマワリは同じ古倍数性イベント（WGT-γ、WGT-1、およびWGD-2）を経験し、それらのゲノム間に多くの共線領域がありましたが（補足図3）、これら2つの種は異なる染色体再配列パターンを経た可能性があり、分岐後に重複して遺伝子が失われ、その結果、異なる染色体数とゲノムサイズが生じます。

配列相同性に基づいて、上記の8つの植物（アウトグループとしてアステリドおよびビニフェラから7つ）の予測遺伝子を使用して、276,277個の遺伝子を含む合計41,701個の遺伝子ファミリーが同定されました（図3aおよび補足表11）。これらのうち、68,964個の遺伝子からなる5749個の遺伝子ファミリーが8つの植物すべてで共有され、12,326個がキク科の5つの植物で共有されました（図3b）。 40,214 個のステビア遺伝子を 20,147 ファミリーに割り当てたところ、1,057 遺伝子ファミリーにステビアに固有の 4,281 個の遺伝子が含まれることがわかりました。ジーンオントロジー（GO）濃縮分析により、これらのユニークな遺伝子ファミリーは主に、RNA指向性DNAポリメラーゼ活性（GO:0003964）、アスパラギン酸型エンドペプチダーゼ活性（GO:0004190）、およびRNA結合（GO:0003723）に関与していることが明らかになりました（補足）図4）。

a 種の系統樹にマッピングされた赤と青の数字は、それぞれ拡大と縮小を受けた遺伝子ファミリーを示します。 b ステビアおよびキク科の他の 4 つの植物の共有遺伝子ファミリーのベン図。 c ステビアのテルペンシンターゼ (TPS) 遺伝子ファミリーの系統樹。 TPS サブファミリーにはラベルが付けられています。

さらに遺伝子ファミリー分析を行ったところ、ステビアゲノムでは323の遺伝子ファミリーが拡大し、346の遺伝子ファミリーが縮小したことが実証されました（図3a）。ステビアの拡張遺伝子ファミリーの GO 濃縮分析により、トランスフェラーゼ活性 (GO:0016758)、モノオキシゲナーゼ活性 (GO:0004497)、ADP 結合 (GO:0043531)、触媒活性 (GO:0003824)、およびテルペンが濃縮されていることが明らかになりました。シンターゼ活性 (GO:0010333) (補足図 5)。 KEGG 濃縮分析により、ステビアの拡張された遺伝子ファミリーは主にフェニルプロパノイド生合成 (ko00940)、テルペノイド骨格生合成 (ko00900)、フラボノイド生合成 (ko00941)、モノテルペノイド生合成 (ko00902)、シアノアアミノ酸代謝 (ko00460)、セスキテルペノイドおよびトリテルペノイド生合成（ko00909）（補足図6）。 GO および KEGG 濃縮分析により、これらの拡張された遺伝子ファミリーのかなりの数が特殊な代謝産物の生合成に関与していることが実証されました。テルペノイド生合成経路が何度か強化されたため、テルペノイドの多様化を促進するテルペン合成酵素 (TPS) 遺伝子ファミリーの拡大パターンをさらに調査しました。ステビアゲノムでは 82 個の TPS 遺伝子が同定され、5 つのサブファミリーに分類できます。ステビア TPS 遺伝子の 4 分の 3 以上が TPS-a および TPS-b サブファミリーに分類され、これら 2 つのサブファミリーの大幅な拡大が示されました (図 3c)。

ステビアの最も注目すべき特徴は、葉に大量の SG が蓄積していることです。 SG 生合成経路は過去 20 年間に広く研究されており、重要な UGT 遺伝子の一部は十分に特徴付けられていますが 21,33、ゲノム解析とトランスクリプトーム解析を組み合わせることで、SG 生合成に関する新たな洞察が得られました。すべてのテルペンは、MEP 経路またはメバロン酸 (MVA) 経路を通じて生成される 5 炭素イソプレノイド単位に由来します 34。 MEP および MVA 経路の候補遺伝子は、相同体検索および機能アノテーション法を使用して同定されました。トランスクリプトーム解析により、MEP経路のほぼすべての候補遺伝子が、SGが多く蓄積している、異なる発育段階の葉を含む7つの選択された組織で発現していることが明らかになりました（図4）。しかし、MVA経路におけるHMGRおよびMKの発現レベルは葉では欠損しており、SG生合成のための5炭素イソプレノイド単位がMVA経路ではなく主にMEP経路に由来することを示しており、これは以下から得られた結論と一致している。標識実験の結果11．

SG 生合成の経路を示す図。破線のボックス内は、ステビアの固有の SG 生合成経路です。 b SGs生合成経路の候補遺伝子の発現パターン。苗期のRS根、苗期のSS茎、苗期のLS葉、栄養期のLV葉、つぼみ期のLB葉、開花初期のLIF葉、開花最盛期のLPF葉

SG の生合成は、ent-カウレン酸生成前の GA の生合成と 4 つのステップを共有しているため、14 個のゲラニルゲラニル二リン酸 (GGPP) シンターゼ (GGPPS) 遺伝子、7 個の ent-コパリルを含む、この共通の経路に関与するすべての候補遺伝子を同定しました。二リン酸シンターゼ（ent-CPS）遺伝子、5つのent-カウレンシンターゼ（ent-KS）遺伝子、および6つのent-カウレンオキシダーゼ（ent-KO）遺伝子（図4）。 4種類の遺伝子はすべてステビアゲノム内のマルチコピー遺伝子であり、相同遺伝子はこれらの重複遺伝子のサブ機能化または新機能化を反映して発現の差異を示しました（図4b）。ステビアは、維管束植物の GA 生合成経路の保存された初期段階に基づいて SG を生合成するように進化しました。

ステビオール配糖体の生合成は、ent-KAH による ent-カウレン酸の 13 位水酸化により GA 生合成から分岐します。多数の P450 からの ent-KAH の進化は、ステビアにおける SG 生合成の重要なステップでした。しかし、そのコード遺伝子のクローニングはまだ成功していません3,35。ステビアのいくつかの潜在的な ent-KAH 遺伝子が NCBI データベースに登録されており、そのほとんどは CYP716 ファミリーに属しています。対照的に、シロイヌナズナの CYP714 ファミリーのメンバーである CYP714A2 は、酵母で発現すると ent-カウレン酸の 13 位水酸化を触媒することが報告されています 36。したがって、ステビアゲノム内の CYP716 および CYP714 ファミリーのすべての推定メンバーを同定しました。 CYP716 遺伝子の大幅な拡大があり、4 つのタンデムに重複した遺伝子 (Streb.1G007430、Streb.1G007460、Streb.1G007470、および Streb.1G007480) が、SG 生合成を伴う葉で一貫して高度に発現されました (補足図 7)。対照的に、ステビアゲノムにはCYP714ファミリーのメンバーが1つだけ存在し（Streb.8G019490）、葉ではほとんど発現されませんでした（図4b）。ステビオールの形成後、一連のUGTによって触媒される連続的なグリコシル化プロセスにより、さまざまな種類のSGが生成されます（図4a）。 UGT 遺伝子は、ステビアの拡張された遺伝子ファミリーの中で高度に濃縮されました (GO:0016758、P < 0.001)。合計で、ステビアゲノム内の259の推定UGT遺伝子を同定し、SGに関与すると報告されている3つのUGT遺伝子を含む、86のUGT遺伝子が選択された5つの葉組織のうちの少なくとも2つで発現されました（補足図8）。生合成 (UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1)。ゲノム解析およびトランスクリプトーム解析を通じてこれらの候補 UGT 遺伝子を発掘することで、特定の SG グリコシル化に関与する UGT 遺伝子の同定が加速されます。

肥満は何百万もの人々が影響を受ける世界的な深刻な健康問題であり、糖分の多い食事は肥満の主な原因の 1 つです。カロリーゼロの甘味料に置き換えて砂糖の摂取量を減らすことは、食事のエネルギー消費を減らす効果的な方法です。サッカリン、アスパルテーム、スクラロースなどの人工甘味料は、日常的に使用されているさまざまな食品に広く添加されていますが、これらの砂糖代替品の長期摂取は健康リスクを引き起こす可能性があります 37,38。天然のゼロカロリー甘味料に対する強い需要があり、SG が最も有望な候補となる可能性があります。ステビオール配糖体は、食品および飲料への使用が世界中の主要な規制当局によって承認されています。高収量と、Reb A、Reb D、Reb M などの最もおいしい SG のレベルの向上が、現在ステビアの育種の主な目標となっています。

これまでのところ、ステビアの固有のジテルペン (SG) についての深い洞察を提供する、ゲノム法とトランスクリプトーム法を組み合わせた包括的な分析はありません。ゲノムのサイズが大きく、複雑さが高く、リピート率が高いため、第 2 世代シークエンシングのみに基づいて高品質のステビアゲノムアセンブリを構築することは依然として非常に困難です 39。ここでは、ステビアの染色体レベルのゲノムアセンブリを提案します。 1416 Mb にわたるステビアゲノムが得られ、コンティグ N50 は 616.85 kb、スキャフォールド N50 は 106.55 Mb でした。我々は、相同性ベース、非経験的、RNA Seq 支援予測法を使用して、現在のアセンブリ内の 44,143 個のタンパク質コード遺伝子を予測しました。この数は、第 2 世代の短い配列を使用して組み立てられた以前のゲノム (24,994) のほぼ 2 倍であり、これはおそらく、ゲノムの 411 Mb しか以前に組み立てられていなかったためであると考えられます 39。したがって、この研究で長い配列と Hi-C アプローチを使用して組み立てられたゲノムは、以前に短い配列のみを使用して組み立てられたゲノムよりも優れています。

ステビアゲノムの 5 分の 4 以上は反復要素で構成されており、そのうち 21.02% はコピア系統に属し、43.44% はジプシー系統に属していました。ヒマワリでは、ゲノムの 4 分の 3 以上が LTR-RT で構成されており、その 59.9% はジプシー系統に属し、25.8% はコピア系統に属していました 24。 C. nankingense では、反復要素がゲノムの 69.6% を占め、その中で LTR-RT (ジプシーおよびコピア) が最も豊富でした 26。多くの反復配列、特に LTR-RT を持つことは、キク科の重要な特徴であり、そのメンバーのゲノムサイズに寄与している可能性があります。

ステビアと他のキク科植物の比較ゲノム分析は、キク科におけるステビアのゲノム進化に関する重要な手がかりを提供しました。私たちの結果は、ステビアとヒマワリが、MRCAで発生したWGDイベント（WGD-2、約3,210万年）の直後に、約2,940万年で分岐したことを示しました（図2a、b）。キク科のメンバーであるステビアも、キク科で基礎的な WGT-1 イベントを経験し、すべての真正双子葉類で WGT-γ イベントが発生しました 24、25、32。ステビアゲノムに存在するシンテニックブロックのほとんどは最近のWGD-2イベントに由来するものでしたが、古代のWGT-1イベントに由来するシンテニックブロックはほとんど保存されていませんでした（図2b）。ステビアは、ヒマワリと共通の祖先から分岐した後、他の植物には見られない独特の代謝産物である SG を合成するように進化しました。特定の遺伝子ファミリーの拡大は、植物の表現型の多様化の促進や新しい形質の進化において重要な役割を果たす可能性があります40,41。ステビアで拡張された遺伝子は、主に特殊な代謝産物の生合成、特にテルペノイド骨格の生合成、およびこれらの化合物のさらなる酸化とグリコシル化のために濃縮されました（補足図5、6）。さらに、ゲノム配列に基づいてSG生合成経路のすべての候補遺伝子を同定し、ステビオール生合成に関与する必須遺伝子が複数コピー遺伝子であることを発見しました（図4b）。これらの重複遺伝子は、ステビアの SG 合成能力に重要な役割を果たしている可能性があります。したがって、この高品質の染色体レベルのゲノムアセンブリは、ステビアの特性を探求する研究者にとって間違いなく有益となるでしょう。

栽培二倍体ステビア種「中山7号」の実生段階に存在する新鮮な若葉を、南京植物園Memにあるステビア生殖質資源研究室から収集した。孫文。ゲノム DNA は、Illumina および PacBio シークエンシングのために単離されました。 Illumina シーケンスでは、Illumina HiSeq プラットフォーム (Illumina、CA、USA) でショートリード (270 bp) ライブラリーを構築およびシーケンスし、141.90 Gb のクリーンリードが得られました。 PacBio シーケンスでは、メーカー (Pacific Biosciences、カリフォルニア州、米国) の指示に従って、ゲノム DNA を約 20 kb に断片化してロングリードライブラリーを構築し、その後ライブラリーを PacBio Sequel プラットフォームでシーケンスしました。低品質のリードとシーケンスアダプターをフィルターで除外した後、N50 値が 12.82 kb の 114.95 Gb のクリーンなサブリードが得られました。

de novo ゲノムアセンブリでは、最初に Canu (v1.5)42 を使用して、PacBio サブリードの潜在的なエラーを修正しました。次に、WTDBG (v1.2.8)、FALCON (v0.7)43、および Canu (v1.5) を使用して、高品質の PacBio サブリードが個別に組み立てられました。これら 3 つのアセンブリ戦略により、1.36、3.25、および 2.03 Gb のアセンブリが得られ、これら 3 つのアセンブリのコンティグ N50 サイズは、それぞれ 205.51、59.71、および 277.70 kb でした。さらに、Quickmerge44 を使用して、適切にアセンブルされた WTGDB アセンブリと Canu アセンブリをマージしました。アセンブリシーケンスのインデルと SNP エラーを修正するために、Pilon45 を使用してペアエンド Illumina リードをマージされたアセンブリにマッピングしました。最後に、PacBio ロングリードを使用してアセンブルされたゲノムのサイズは 1.40 Gb で、コンティグ N50 値は 616.85 kb でした (補足表 3)。アセンブリの品質を評価するために、BWA46 を使用してショートペアエンドリードを最適化されたコンティグにマッピングし、CEGMA47 および BUSCO23 分析を実行しました。

染色体レベルのゲノムアセンブリの Hi-C シークエンシングは、前述のように実行されました 48。簡単に説明すると、「中山 7 号」の実生段階に存在する新鮮な若葉を収集し、ホルムアルデヒド溶液で固定しました。 HindIII を使用して、固定された葉から抽出されたクロマチンを消化しました。次いで、ＤＮＡ断片を一緒に連結して、ビオチン化後にキメラ接合部を形成した。次に、濃縮されたキメラ接合部を物理的に切断して、長さ 300 ～ 700 bp の DNA 断片を作成しました。ビオチンを含む DNA フラグメントはストレプトアビジンプルダウンによって濃縮され、その後 Illumina HiSeq シークエンシングに供されました。最終的に、約 76.86 Gb のクリーンな Hi-C 読み取りが生成されました。

HiC-Pro49 を使用して Hi-C シーケンスデータを評価しました。 Hi-C シーケンスデータは、BWA-aln46 を使用して組み立てられたコンティグにマッピングされました。事前に組み立てられた足場は、平均 50 kb のセグメントに分割され、LACHESIS ソフトウェア 22 を使用して組み立てるための独自のマッピングされたリードと結合されました。最終的な染色体アセンブリを評価するために、それらを同じ長さ (100 kb) のビンに分割し、ヒートマップで相互作用行列を視覚化しました。

De novo 検索と相同性に基づくアラインメントを使用して、ステビアゲノム全体の反復配列を予測しました。まず、PILER-DF (v2.4)50、RepeatScout (v1.0.5)51、および LTR_FINDER (v1.05)52 を使用して de novo 反復シーケンスを予測し、PASTEClassifier53 を使用してそれらをファミリーに分類しました。次に、RepeatMasker (v4.0.6)54 を使用して、de novo 反復配列と既知の Repbase55 TE ライブラリの統合データベースをスキャンしました。

私たちは、相同性ベース、ab initio、および RNA Seq 支援アプローチを使用して、ステビアゲノムアセンブリ内のタンパク質コード遺伝子を予測しました。 Augustus56、GlimmerHMM57、SNAP58、および GeneID59 は、ab initio プログラムに使用されました。相同予測では、Phytozome から A. thaliana、H. annuus、L. sativa、Oryza sativa のタンパク質配列をダウンロードし、TBLASTN60 を使用して組み立てられたステビアゲノムと位置合わせしました。次に、GeMoMa61 を使用して、一致するタンパク質に対して相同なゲノム配列をアライメントし、正確なタンパク質コード遺伝子モデルを構築しました。 RNA Seq 支援予測では、ステビアのさまざまな器官からの RNA シーケンシングリードがアセンブリにマッピングされ、これらのマッピング結果からの転写物が GeneMarkS-T62 と TransDecoder (https://github.com) を使用して同定されました。上記の 3 つのアノテーション手順で得られたすべての遺伝子モデルを EVM63 と統合して最終的なコンセンサスセットを構築し、PASA (v2.0.2)64 でフィルタリングしました。次に、これらの予測されたタンパク質コード遺伝子は、TrEMBL65 および NCBI の非重複タンパク質データベースを含む公開データベースに対して BLAST に割り当てられました。 Blast2GO66 を使用して、GO67 および KEGG68 データベースに基づいて機能と経路を決定しました。

OrthoMCL69 を使用して、8 つの植物 (V. vinifera、S. lycopersicum、D. carota、L. sativa、C. nankingense、A. annua、H. annuus、および S. rebaudiana) 間のオルソロガスグループを同定しました。 BLASTP (E 値: 1e-05) を使用して全対全比較を実行し、OrthoMCL を使用してオルソロガスグループをクラスター化しました。私たちは MAFFT70 を使用して 799 個のシングルコピー遺伝子のタンパク質配列をアラインメントし、Gblocks でアラインメントが不十分な領域を削除し 71、RAxML (v8.0.0)72 を使用した系統解析のためにアラインメント結果を連結しました。 PAML パッケージ内の MCMCTREE (v4.0) を使用して種の分岐時間を推定しました 73。 V. vinifera-H の推定分岐時間。 annuus (1億1100万〜1億3100万年)、S. lycopersicum-D. carota (95 ～ 106 Mya) および L. sativa-A. TimeTree (http://www.timetree.org) の annua (34 ～ 4000 万年) を使用してツリーを調整しました。 8 つの植物において OrthoMCL によってクラスター化された遺伝子ファミリーの拡大と縮小は、CAFÉ (v4.2) を使用して決定されました74。

BLASTP (E 値: 1e-05) を使用して全タンパク質対全タンパク質配列の比較を実行し、相同遺伝子ペアを同定しました。種内および種間のシンテニックブロックは、MCScanX30 を使用して決定されました。 Perl スクリプト「add_ka_and_ks_to_collinearity.pl」。 MCScanX パッケージに実装されたを使用して、共線性相同遺伝子ペアの Ks 値を計算しました。キク科 5 種については、アステリドの中性置換率 (r = 8.25E−9) を適用して、WGD または種分化事象の分岐日を計算しました 24。 TBtools75 を使用して、ステビア、レタス、ヒマワリのシンテニックブロック図と、ステビアとヒマワリの間のコード遺伝子のドットプロットを描画しました。ステビアゲノムのシンテニックブロックとゲノム特徴の画像は、Circos (v0.69)76 を使用して作成されました。

Illumina のショートリードと PacBio のロングリードは、BioProject ID PRJNA684944 で NCBI SRA データベースに登録されています。トランスクリプトームデータは、BioProject ID PRJNA705537 として NCBI SRA データベースに保管されています。最終的な染色体スケールのゲノムアセンブリと注釈データは、Figshare データベース (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.14169491.v1) に保管されています。

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リファレンスをダウンロードする

この研究は、中国国家自然科学財団 (31701497 および 31601371)、江蘇省自然科学財団 (BK20160600 および BK20180312)、および植物資源の研究と利用に関する江蘇重点実験室 (JSPKLB201801 および JSPKLB201832) の支援を受けました。

これらの著者は同様に貢献しました: Xiaoyang Xu、Haiyan Yuan

江蘇省植物研究所および中国科学院/農業遺伝資源の保存と利用のための江蘇省プラットフォーム、南京、210014、江蘇省、中国

Xiaoyang Xu、Haiyan Yuan、Suzhen Huang、Yuming Sun、Ting Zhang、Qingquan Liu、Haying Tong、Yongxia Zhang、ying Jie Wang、Menglan Hou、Yongheng Yang

南京農業大学園芸学院、南京、210095、江蘇省、中国

夏清裕

江蘇農業科学アカデミー/江蘇園芸作物遺伝子改良重点研究所、南京、210014、江蘇省、中国の果樹研究所

劉春暁

Biomarker Technologies Corporation、北京、101300、中国

レイ・ウー

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XX、YY、HY がこの研究を発案しました。 HT、YW、および YZ はサンプルを収集しました。 LW と XX はゲノム配列決定を実行しました。 XX、XY、SH、YS、CL、TZ、QL、および MH がデータ分析を実行しました。 XX と HY が原稿を書きました。そしてYYが原稿を修正しました。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

楊永恒への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

補足図 1 ～ 8この記事には、補足表 1 ～ 11 と補足図 1 ～ 8 の 2 つの補足ファイルのみが含まれています。重複した補足ファイルを削除してください。よろしくお願いします。

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転載と許可

Xu, X.、Yuan, H.、Yu, X. 他染色体レベルのステビアゲノムは、ステビオールグリコシド生合成についての洞察を提供します。 Hortic Res 8、129 (2021)。 https://doi.org/10.1038/s41438-021-00565-4

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受信日: 2020 年 11 月 23 日

改訂日: 2021 年 3 月 7 日

受理日: 2021 年 3 月 14 日

公開日: 2021 年 6 月 1 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41438-021-00565-4

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