朱色と辰砂は目の単色色素生合成に関与しているが、Bicyclus anynana 蝶の羽には関与していない

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9368 (2023) この記事を引用

メトリクスの詳細

体内の異なる組織で同じ色素が見つかった場合、同じ代謝経路が各組織で同様に展開されていると考えるのが自然です。今回我々は、これが蝶の目や羽に見られる赤とオレンジ色の色素であるオモクロムには当てはまらないことを示す。私たちは、両形質が赤みがかった/オレンジ色の色素をもつビシクルス・アニナナ蝶の目と羽の色素の発達における、オンモクローム経路における2つの既知のハエ遺伝子である朱色と辰砂の発現と機能をテストしました。蛍光 in-situ ハイブリダイゼーション (HCR3.0) を使用して、個眼の色素細胞の細胞質における朱色と辰砂の発現を局在化しましたが、幼虫と蛹の羽ではどちらの遺伝子も明確な発現は観察されませんでした。次に、CRISPR-Cas9 を使用して両方の遺伝子の機能を破壊したところ、目では色素が失われましたが、羽では色素が失われませんでした。薄層クロマトグラフィーと紫外可視分光法を使用して、オレンジ色の羽の鱗と蛹の体液中にオモクロムとオモクロム前駆体が存在することを確認しました。私たちは、翼がまだ未確認の酵素を使用して局所的にオムモクロームを合成しているか、または血リンパから他の場所で合成されたこれらの色素を取り込んでいると結論付けています。したがって、異なる代謝経路または輸送機構により、B. anynana 蝶の羽と目にオムモクロームが存在することになります。

オムクロムは、さまざまな種に見られる赤/オレンジ色の色素で、さまざまな機能を果たします。これらは甲殻類、クモ、昆虫の色素を含む細胞に存在し、色のパターン化、視覚的フィルタリング、UV 保護、トリプトファンの解毒において重要な役割を果たしています1。昆虫の眼の光学単位である昆虫個眼の色素細胞に見られるオムクロムは、光受容細胞の保護と眼全体の色素沈着において重要な役割を果たしています1、2、3。 Elymnias hypermnestra tinctoria 4、Junonia coenia 5,6、Agraulis vanilla 7 などの蝶の羽の赤とオレンジの色斑に見られるオムクロムは、おそらく交尾相手の誘引や捕食者回避のシグナル伝達の役割を果たしていると考えられます。

オムクロムはオムクロム生合成経路を介して生成され、その酵素は主にキイロショウジョウバエ 8、トリボリウムカスタネウム 9、ネッタイシマカ 10、鱗翅目のカイコ 11 やプルテラキシロステラ 12 などの昆虫モデル系の眼で研究されてきました。この経路では、アミノ酸のトリプトファンが、細胞の還元環境に応じて黄色から赤色になる色素キサントマチンとジヒドロキサントマチンに変換されます13。ショウジョウバエでは、この経路の異なる酵素をコードする 4 つの主要な遺伝子には、バーミリオン、キヌレニンホルムアミダーゼ (kfase)、辰砂、およびカージナルが含まれます 12。トリプトファンがモノカルボン酸トランスポーターと推定されるカルモイシン14によって色素細胞に取り込まれた後、バーミリオンはトリプトファンをホルミルキヌレニンに変換するトリプトファンオキシゲナーゼをコードします15。キヌレニンホルムアミダーゼ (kfase) は、ホルミルキヌレニンをキヌレニンに変換する同名の酵素をコードします16。辰砂は、キヌレニンを 3-ヒドロキシキヌレニンに変換するキヌレニン 3-ヒドロキシラーゼをコードします12。最後に、カーディナルは、還元化学条件下で 3-ヒドロキシキヌレニンからキサントマチン (オレンジ色) への変換を触媒するフェノキサジノンシンテターゼをコードし、キサントマチンはさらにジヒドロキサントマチン (赤色) に変換できます 13。

同じオムモクローム酵素をコードする遺伝子の一部、オムクローム代謝物前駆体、目のオムクロ転写因子制御因子も、いくつかのタテハチョウ科の蝶の羽で確認されています。 Vanessa Cardui では、トリプトファンは翅の赤とベージュ色の領域に組み込まれており 17、発達中の Heliconius Erato 翅の赤色色素領域には朱色と辰砂の両方の発現が見られます 18。その後の研究では、optix が蝶のオモクローム色素の存在を制御する重要な転写因子の 1 つであることが特定されました 19。そのノックアウトにより、複数の種の蝶で赤とオレンジ色の色素沈着が失われ、オモクローム色素の下方制御がもたらされたためです。羽の経路関連遺伝子20．しかし、蝶の羽の単色色素の生成における朱と辰砂の直接的な役割はテストされていません。

Bicyclus anynana 蝶では、optix と既知のオムモクローム経路遺伝子との関係も不明ですが、ゲノム配列が決定されており、発現および機能解析のための豊富な遺伝ツールがあるため、このような経路を研究するのに適したシステムです。 optix は、そのノックアウトによりオレンジ色が失われるため、この種の翅の眼点パターンにおける将来のオレンジ色の鱗片細胞の色素沈着に明らかに関与しています。しかし、既知のオムモクローム経路遺伝子が B. anynana の翅でのオレンジ色の色素生成に必要かどうかは不明です。バーミリオンは、いくつかの時点で B. anynana の蛹の羽のバルク mRNA 抽出物中に同定されています 22 が、CRISPR-Cas9 を使用したバーミリオンのノックアウトでは、羽に対して目に見える効果は示されていません 23。さらに、白と緋色の単色輸送体をノックアウトしても、個眼の色素沈着に影響を与えたにもかかわらず、羽に目に見える表現型は生じませんでした 23 。これらの結果は、(1) オムモクローム経路遺伝子が、これまでのところ CRISPR ツールでヒットされていない B. anynana の翅上の少数の細胞 (眼点のオレンジ色の輪) で発現していることを示している可能性があります。 (2) オモクロムは B. anynana のオレンジ色の色素ではありません。または (3) オムクロムは B. アニナナの翅では生成されておらず、代わりに他のオムクロム産生細胞からそこに輸送されている。

B. anynana の翅における既知の単色色素遺伝子の関与を調べるために、蛍光 in-situ ハイブリダイゼーションと CRISPR-Cas9 をそれぞれ使用して、朱と辰砂の発現と機能を調べました。また、対照として、発達中の眼における両方の遺伝子の発現と機能も調べました。我々の結果は、これら 2 つのオムモクローム酵素が目の色素沈着に必須であるが、B. anynana の局所的な羽の色素合成には主要な役割を果たしていないことを示しています。次に、薄層クロマトグラフィーと紫外可視分光分析を使用して、眼点のオレンジ色の輪と B. anynana の体液にそれぞれオモクロム色素とオモクロム前駆体の存在を確認しました。私たちは、オモクローム色素が別の供給源から羽に取り込まれているか、この蝶の羽組織でのオモクローム合成に新しい酵素が使用されていると結論付けています。

朱と辰砂の空間的局在と発現パターンを特定するために、我々はまず、HCR3.024を使用して蝶の発達中の眼における発現パターンをテストしました。両方の遺伝子について、個眼色素細胞の細胞質に明確で異なる発現ドメインが観察されました（図1A〜F、S1D、E）。

蛹発育（PD）77％（120時間）におけるBicyclus anynanaの眼における朱色と辰砂の発現と機能。瞳には(A)DAPIと(B)朱を表現。 (C) DAPIと朱の融合表現。目の中の (D) DAPI と (E) 辰砂の発現。 (F) DAPI と辰砂の融合発現。 DAPI は個眼の 4 つの核で発現され、朱色と辰砂の mRNA はこれらの細胞の細胞質に存在します。大人の (G) WT の目、(H) 朱色のぱりっとした目、(I) 朱色のぱりっとした目。朱色のクリスパントはより均質な変異表現型を示しましたが、辰砂のクリスパントは色素沈着が欠如した細胞の斑点を示しました（黒い矢印）。 (J) インデルは、朱色 (赤いボックス) と辰砂のガイド RNA によって標的化された部位の近くで見つかりました。

次に、HCR24 を使用して、B. anynana の幼虫および蛹の羽における朱色と辰砂の発現をテストしました。朱色と辰砂は、ヴァネッサ・カルドゥイとヘリコニウス・エラトにおいて、蛹の発育の40～55％でより高い発現を示すことが以前に示されている17,18。そのため、我々はB.アニナナでその段階までのこれらの遺伝子の発現を調べた。我々は、蛹の段階で眼点のオレンジ色の輪で発現されるoptixの発現ドメインと少なくとも部分的に重複する発現ドメインを期待していました（図2K–M、3K–M、S1、S2）21、25。しかしながら、どの遺伝子も翅に特異的な発現ドメインを示さなかった（図２、３）。しかし、77% (120 時間) および 92% PD (144 時間) では、コントロール染色が示したように、おそらく蛹の翅の発育後期におけるキチンの自己蛍光によるものと思われる、翅全体にわたってわずかに均一でより高い蛍光強度が観察されました。蛍光も同様に増加します（図2G〜J、N、O、3G〜J、N、O）。

Bicyclus anynana の幼虫と蛹の羽の朱色の発現。 (A および B) 幼虫の羽における朱色の発現、(C および D) 31% 蛹の発育 (PD) (48 時間)、(E および F) 61.5% PD (96 時間)、(G および H) 77% PD (120 時間)、および (I および J) 92% PD (144 時間)。翼には朱色の mRNA の特定のドメインは観察されませんでした。 (K-M) 77% PD (120 時間) での vermilion と optix (ポジティブコントロール) の共発現。 77% PD (120 時間) での (N) 前翅と (O) 後翅における朱色のセンス鎖の発現。

B. anynana の幼虫および蛹の羽における辰砂の発現。 (A および B) 幼虫の羽における辰砂の発現、(C および D) 31% 蛹の発育 (PD) (48 時間)、(E および F) 61.5% PD (96 時間)、(G および H) 77% PD (120 時間)、および (I および J) 92% PD (144 時間)。翼には辰砂 mRNA の特定のドメインは観察されませんでした。 (K-M) 77% PD (120 時間) での vermilion と optix (ポジティブコントロール) の共発現。 77% PD (120 時間) での (N) 前翅および (O) 後翅における辰砂センス鎖の発現。

オムモクローム遺伝子が 15% PD (24 時間) の蛹の翅で転写されるかどうかを検証するために、朱色、辰砂、およびキヌレニンホルムアミダーゼに特異的なプライマーを使用して翅全体の cDNA に対して PCR を実行しました。データは、これらの遺伝子のmRNAが蛹の羽に低レベルで存在することを示しており（参照ef1αと比較して）（図S3）、以前の研究のRNA配列データと一致しています26（表S5）。

B. anynana の目と羽における朱色と辰砂の機能を検証するために、CRISPR を使用して両方の遺伝子のコード配列を破壊しました。 WTの目は黒く見えますが（図1G）、朱色のクリスパントの成体は均一な黄色またはピンクの目（n = 5）（図1H）を持ち、辰砂のクリスパントの成体（n = 6）は目のモザイクパッチでより明るい色素沈着を示しました。 (図1I)。目の表現型を示すこれらの個人のほとんど（n = 5朱色、n = 4辰砂）（図S4、S15）は、眼組織から抽出されたDNAのイルミナシーケンスを使用して、CRISPR標的部位のインデルについて確認されました（図1J、K）、S5 ～ S9、S16 ～ S19）。

朱色のクリスパント（図4B〜D、S4）および辰砂（図5B〜D、S15）は、羽の表現型を生成しませんでした。羽で朱色と辰砂がうまくノックアウトされたかどうかを確認するために、目の色素沈着表現型を示したすべての個体の羽でイルミナシーケンスを実行しました。試験したすべての個体（n = 5 朱、n = 6 辰砂）の CRISPR 標的部位のインデルを取得しました（図 4E、S10 ～ S14）、（図 5E、S20 ～ S25）。

Bicyclus anynana の羽には朱色の機能は検出されませんでした。成体 (A および B) WT 翼、および (B ～ D) 朱色のカリカリ翼。 (B ～ D) のそれぞれの翼の (E) 朱色のクリスパントの部位にインデル。成体の翅では、特定の表現型やモザイククローンは観察されませんでした。標的部位の遺伝子破壊は、イルミナシークエンシングによって確認されました。赤いボックスは CRISPR ターゲット部位を強調表示します。

B. anynana の翅では辰砂の機能は検出されませんでした。成体の (A) WT の羽、および (B ～ D) 辰砂のクリスパントの羽。パネル BD のそれぞれの翼からの (E) 辰砂クリスパントの部位のインデル。成体の翅では、特定の表現型やモザイククローンは観察されませんでした。標的部位の遺伝子破壊は、イルミナシークエンシングによって確認されました。赤いボックスは CRISPR ターゲット部位を強調表示します。

HCR（図S26）とCRISPR（図S27）を使用して、追加の既知のオムモクローム生合成遺伝子であるキヌレニンホルムアミダーゼ（kfase）をテストしました。この場合、転写産物は蛹の発生中に個眼細胞に明らかに局在していましたが（図S27;表S5）、kfaseのノックアウトは観察可能な目または羽の表現型をもたらさなかった（n = 5）（図S27）。）。昆虫種については、既知の kfase 変異体は報告されていません 1。

朱色と辰砂による翅の色素沈着の欠陥を確認できなかったため、B. anynana の成体翅のオレンジ色の鱗片領域にオモクローム色素が実際に存在するかどうかをテストすることに興味がありました。 J. coenia に関する研究で翅にオモクロムがあることが以前に確認されていたため、我々は B. anynana のオレンジ色の鱗片から色素を抽出し、さらに 2 つの Junonia 種のオレンジ色領域から色素を抽出しました。我々は、（Rf が既知の）オムモクロムの存在を特定するのに役立つように、既知の保持係数（Rf）を持つ 2 つの対照色素、アマランサスとブロモフェノールブルーを使用して薄層クロマトグラフィー（TLC）実験を実行しました 17（図 6）。我々は、B.アニナナにおけるジヒドロキサントマチンと同じクロマトグラフィーRf値を有する色素の存在を観察した(黒い矢印、図6A;表1)。 J. almana では、オンマチン D の保持特性を持つ色素が高レベルで存在していました (オレンジ色の矢印、図 6C、表 1)。一方、J. orythia では、オンマチン D とキサントマチンが存在する可能性が高いことが示されました (オレンジ色と紫色)。矢印、図6E、表1)。これらの結果は、この種の翅組織には既知のオムモクローム生合成酵素の機能が存在しないにもかかわらず、B. anynana の翅にはオムモクロームが存在することを示しています。ただし、TLC バンド内の色素については、質量分析実験によるさらなる検証が必要です。

B. ananana、J. almana、および J. orythia のオレンジ色の部分から抽出された色素の薄層クロマトグラフィー (TLC)。 (A、B) ジヒドロキサントマチンの保持係数 (Rf) 値 (黒い矢印) のバンドを示す B. anynana のオレンジリングから抽出された色素。（C、D）オンマチン-DのRf値（オレンジ色の矢印）でバンドを示すJ.アルマナのオレンジ色のリングから抽出された色素。 (E、F) キサントマチンおよびオンマチン D の Rf 値でのバンドを示す J. orythia のオレンジ色の環から抽出された色素 (紫とオレンジの矢印)。対照色素のアマランスとブロモフェノールブルーは、それぞれ赤と青の色素として移行します (赤と青の矢印)。ブロモフェノールブルーにはさらに 2 つの茶色と黄色のバンドがあり、アマランサスにはさらに赤いバンドがあります。 (G) 77% (120 時間) PD 蛹血リンパ色素抽出物の紫外可視スペクトル。キヌレニン (赤、366 nm)、キサントマチン (青、440 nm)、およびジヒドロに対応すると思われる波長で色付きの破線でマークされた 3 つのピークを示しています。 -キサントマチン (緑色、470 nm)。

B. anynana の翅にオモクロムがどのように存在するかをさらに調べるために、我々は、オモクロムとその前駆体が蛹の発育中に血リンパから取り込まれ、翅の鱗に組み込まれるのではないかという仮説を検証しました。 77％（120時間）PDで個体の体液から色素を精製し、その吸光度スペクトルを得ました（図6G）。 366 nm、440 nm、470 nm のさまざまな波長で吸光度のピークが観察されました。以前に報告された値 27、28、29 に基づいて、これらの波長は、それぞれキヌレニン、キサントマチン、およびジヒドロキサントマチンが血リンパ中に存在する可能性を示しています。これらの結果は、オモクロムが B. anynana の翅に出現するメカニズムの 1 つが、血リンパからの輸送を介している可能性があることを示しています。

B. anynana では、オモクローム酵素の朱色と辰砂が、蛹の発育中に個眼の色素細胞で発現され、色素合成で機能します。両方の遺伝子は、目では約77％PD（120時間）で転写され（図1A〜F）、転写物は31％PD（48時間）および46％PD（72時間）という早い段階で検出されます（図S1D、E））。各個眼では、発現は一次色素細胞と二次色素細胞が位置する周辺部に限定されていました1(図1A～F)。ほとんどの朱色のクリスパントは均一な淡いオレンジ色の目の色をしていましたが(図1H)、辰砂のクリスパントはほとんどが目の中に明るい赤い斑点がありました(図1I)。これらの結果は、アケタ・ドメスティクスやヘノセピラクナ・ヴィギンティオクトプンクタタなどの他の昆虫種での発現研究や、成体個眼を変化させたトリボリウム・カスタネウム、ネッタイシマカ、プルテラ・キシロステラ、ナソニア・ビトリペニス、ヘリコバパ・ゼアの朱色や辰砂のノックアウト研究と同様である。着色9、10、12、15、32。

蛹の羽には両方の酵素をコードするmRNAが存在し、成体の羽にもオムモクロームが存在する可能性があるにもかかわらず、朱も辰砂もB. anynanaの羽のオムモクローム合成において機能的な役割を果たしていない。私たちの実験では、92％PD（144時間）以前は、幼虫と蛹の羽と眼点でこれらの遺伝子の目立った発現は見られませんでした（図2、3）。 CRISPR-Cas9 を使用したこれら 2 つのオムモクローム酵素の機能検証でも、インデルを含むリードの大部分が存在するにもかかわらず、B. anynana の翅に観察可能な表現型は生じませんでした (図 4、5、S4、S15)。翼細胞の大部分でノックアウトが成功しました（図4、5、S10〜S14、S20〜S25）。成功したアイクリスパントのすべての羽でこれらの遺伝子の遺伝的破壊が確認されているにもかかわらず、翅全体で朱色と辰砂の強い発現が見られないことと、CRISPR表現型が欠如していることは、これらの遺伝子が羽のオモクローム合成に役割を果たしていないことを示唆している。 B. アニナナの翼。これらの遺伝子が、Heliconius Erato、Vanessa Cardui、Junonia coenia などの他の種の翅における局所的なオムクロム合成に役割を果たしているかどうかも、両方の遺伝子を使った直接の機能試験が待たれます。

機能的に冗長なオムモクローム合成遺伝子の存在は、B. anynana においてさらに調査する必要があるでしょう。このような機能的重複は、羽に表現型が存在しないことを説明する可能性があり、羽には朱色や辰砂の役割が他の遺伝子によって担われている可能性がある。 WT の翅における kfase の明らかな発現の欠如、および kfase クリスパントの突然変異表現型の欠如は、この遺伝子が B. anynana の翅での単色合成において機能していない可能性があることを示唆しています。しかし、これらのクリスパントでは、インデルの存在は確認されませんでした。さらに、カージナルなどの他の経路酵素の機能は、B. アニナナではまだ調査されていません。

今回我々は、オムモクローム色素が B. anynana の翅にあるオレンジ色のリングの一部である可能性が高いことを示しました。他の蝶におけるオムクロムの上流調節因子であるoptix21の発現および機能データのみに基づいて、オムクロムがこの種の眼点のオレンジ色の輪の着色に関与していると提案された20。しかし、薄層クロマトグラフィーを使用すると、眼点のオレンジ色の鱗片領域に、オムモクロームジヒドロキサントマチンと（Rf 値で）一致する少量の色素が同定されました。これらのオモクロムの正体は、おそらくジュノニアの羽に存在するオモクロム色素とは異なるものと考えられます。ただし、昆虫の目の個眼色素細胞について説明したように、これらの単色色素は、SEMで観察されるように33（図S28）、目に見える色素顆粒の翅鱗に沈着しているようには見えません34。ただし、TLC を使用して観察される顔料の正確な分子同一性は、質量分析を使用してさらに確認する必要があります。

B. anynana では、羽に見られるオモクロームおよび/またはオモクローム前駆体が別の器官で合成され、血リンパを介して輸送され、オモクロームトランスポーターを介してオレンジ色の鱗に取り込まれる可能性があります (図 7)。同様の輸送機構が、ヘリコニウス蝶の羽にある前駆体 3-ヒドロキシキヌリンについても仮説が立てられています 18。初期の研究では、オムモクローム生合成の代謝産物が、ある組織から血リンパに分泌され、別の組織タイプによって処理されることが実証されています。 Ephestia kühniella 幼虫では、キヌレニン 3-ヒドロキシラーゼ (辰砂) の活性はマルピーギ管にのみ局在しており、その酵素生成物 3-ヒドロキシキヌレニンは、トリプトファンやキヌレニンなどの色素経路の初期の代謝物とともに幼虫の血リンパで検出されました。。 7）。この種の蛹個眼は、代謝産物が血リンパに注入されると、血リンパに含まれる 3-ヒドロキシキヌレニンを取り込んでオムモクロームを生成することができます 36。 Araschnia levana 蝶の蛹では、赤い色素が翅の鱗に現れたため、血リンパ内で 3-ヒドロキシキヌレニンの増加が見られ、放射性標識された 3-ヒドロキシキヌレニンの注射により、翅へのその取り込みが赤い鱗の空間的局在化と一致していることが明らかになりました 37。アゲハでは、キヌレニンは蛹の発育中に体リンパ中を自由に循環し、個眼の単色形成が始まると濃度が増加し、赤翅の色が現れると急激に減少します 38。これらの研究は、これらの分岐した蛾や蝶の種の羽（および目）に見られるオムモクロームが血リンパに由来する可能性があることを示唆しています。

Bicyclus anynana 蝶の個眼色素細胞およびオレンジ色の鱗片細胞における単色色素の生合成および/または取り込みのメカニズム。個眼色素細胞では、トリプトファンは提唱されているカルモイシントランスポーターによって取り込まれ、Vermilion、Kfase、Cinnabar 酵素の存在下で 3-ヒドロキシキヌレニン (3-OHK) に変換されます。 3-OHK はトランスポータータンパク質のホワイトとスカーレットによって色素顆粒の内部に取り込まれ、そこでキサントマチンとジヒドロキサントマチンに変換されます。オレンジ色の鱗では、トリプトファンが未知の機構によって 3-OHK に変換されるか、未知のトランスポーターを介して体リンパから鱗の細胞に輸送され、そこでキサントマチンおよびジヒドロキサントマチンに変換されます。また、鱗片細胞にはオモクロムの色素顆粒が存在しないことも提案します。ショウジョウバエにおけるトリプトファンの取り込みにおけるカルモイシンの関与に関する直接的な証拠はないことに注意してください。

朱色と辰砂の発現を欠く翅にオモクロームが存在することを説明する別のメカニズムには、翅と目に異なる酵素を使用することが含まれる可能性があります（図7）。ヴァネッサ・カルドゥイでは、羽の異なる色の領域にわたって遺伝子発現差解析が行われ、単色色素沈着に関与する可能性のある 26 個の遺伝子が特定されました。これらの遺伝子には、optix、kfase、cinnabar、7 つの主要促進因子スーパーファミリー (MFS) トランスポーター、2 つの幼若ホルモン結合タンパク質、および 2 つの未分類トランスポーターが含まれます 39。注目すべきことに、白と緋色の単色輸送体遺伝子は、試験された時点とV. Carduiの翅の異なる色の領域との間で差次的に発現されることは見出されなかった。ヘリコニウスでは、レッドウィングのパターンに関連する 3 つの新規トランスポーター遺伝子の発現も見つかりました 40。 B. anynana では、白色および緋色のオムクロームトランスポーターの CRISPR ノックアウトによっても、翅に目に見える表現型は生じませんでした 23 。これは、これらすべての種の鱗片細胞に新規酵素およびオムクロームトランスポーターが存在する可能性を示唆しています。したがって、進化の過程で、目に使用されているものとは異なる酵素やトランスポータータンパク質がB.アニナナの翅に配備されてきた可能性があります。

結論として、我々は、バイシクルス・アニナナ蝶の翅ではなく、目の局所的な色素生成に単色生合成酵素である朱色と辰砂が関与していることを示した。これらの酵素は、最終的に羽のオレンジ色の領域に沈着するオムクロム色素の生成に依然として関与している可能性がありますが、羽の細胞自体では機能していないようです。淡色色素または色素前駆体は、調査された 2 つの酵素ステップの後に鱗片セルに輸送されるか、または新しい酵素を介してその場で合成されます。

HCR3.0 は、以前に説明されたプロトコル 24 に基づいて実行されました。簡単に説明すると、所望の蛹化後の時点における翅および複眼組織を室温の1X PBS溶液中で解剖し、1X PBS中に4%のホルムアルデヒドを含むガラスウェルに固定した。室温で３０〜４０分間固定した後、組織を１ＸＰＢＳで３分間２回洗浄し、次いで０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を補充した１ＸＰＢＳ（１ＸＰＢＳＴ）で２回洗浄した。透過処理は、1.0% SDS、0.5% Tween 20、Tris-HCl (pH 7.5)、1.0 mM EDTA (pH 8.0)、および 150.0 mM NaCl を含む界面活性剤溶液中で組織を 30 分間インキュベートすることによって実行されました。プローブ侵入のための組織透過性を高めるために、より厚い表皮を持つ後期段階（> 60% の蛹発育）の蛹の羽を、200 μL 1X PBST 中の 2.5 μL プロテイナーゼ K で 55 °C で 2 分間消化しました。続いて、翼を氷上に置き、消化混合物を１×ＰＢＳＴ中の２ｍｇ／ｍＬのグリシンに置き換え、反応を停止させた。次に、組織を 1X PBST で 3 回、5X SSCT で 2 回洗浄しました。組織を30％プローブハイブリダイゼーションバッファー中で37℃で30分間インキュベートした後、0.02μMの一次プローブ（朱色、辰砂、およびkfaseに特異的）を含む30％プローブハイブリダイゼーションバッファー中で37℃で16時間さらに長時間インキュベートしました。。組織を 37 °C で 15 分間隔で 30% プローブ洗浄バッファーで 4 回洗浄し、室温で 5X SSCT で 2 回洗浄しました。組織を増幅緩衝液中で室温で30分間インキュベートし、続いて二次蛍光プローブを含む増幅緩衝液中、暗所で室温で12時間インキュベートした。次いで、組織を５×ＳＳＣＴで２０分間隔で４回洗浄し、５×ＳＳＣＴで希釈したＤＡＰＩで５分間インキュベートし、５×ＳＳＣＴで２回洗浄した。組織をマウンティングバッファー中のガラススライド上にマウントし、Olympus FV3000 共焦点顕微鏡で画像化しました。

朱色、辰砂、キヌレニンホルムアミダーゼの CRISPR-Cas9 遺伝子編集は、以下の微調整を加えて前述のプロトコール 41 に従って実行されました。すべての遺伝子について、IDT カスタムガイド設計ツールを使用して合成ガイド RNA (crRNA) を設計しました (補足ファイルの配列)。二本鎖バッファー、Cas9 バッファー、および crRNA と Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA の等モル混合物を含む溶液を 95 °C で 5 分間インキュベートし、Cas9 ヌクレアーゼを添加する前に室温まで冷却しました。

蛹と成体の両方の組織に朱色と辰砂の変異が存在することを確認しました。蛹の羽の組織は、蛹の発育が25〜28％（40〜44時間）または44〜47％（70〜74時間）の個体から解剖されました。 Omega Bio-tek EZNA Tissue DNA Kit (SKU: D3396-01) を使用して DNA を抽出および精製しました。成体のクリスパントでは、目と翼の組織が分離され、両方の組織タイプが上記の DNA 抽出技術を使用して別々に処理されました。増幅された対象領域を含むシーケンスライブラリに対してペアエンドシーケンスを実行し、Geneious v10.1.3 で INDEL の存在を確認しました。

翼切片からの色素抽出は、以前に定義されたプロトコルに従って実行されました5,17。翅のオレンジ色の鱗片領域を、B. anynana、J. almana、および J. orythia の成体翅から細いハサミを使用して分離しました (図 6)。解剖した翼組織を、ホモジナイザー（Next Advance Bullet Blender）内で0.01 mmのジルコニウムビーズを使用して、酸性化メタノール（0.5% HCl）中で均質化した。ホモジネートを14,000 rpmで5分間遠心分離し、上清を真空遠心分離機(ThermoScientific)で30分間乾燥させ、20μlのメタノールで再構成した。顔料混合物、ならびに参照染料のアマランスおよびブロモフェノールブルーをシリカゲルプレート (F254、Merck) 上にスポットし、展開溶媒としてフェノール (SigmaAldrich) を使用して泳動しました。保持係数 (Rf) 値は、ImageJ で測定された溶媒フロントの移動距離に対する顔料化合物の移動距離の比として計算されました。

蛹の発育が61.5％になるまで飼育した後、野生型B.アニナナ個体から蛹の血リンパを抽出した。前に定義されたプロトコル 18 に従い、冷メタノールを使用して蛹の体液から淡色色素を抽出し、無水メタノールで希釈しました。血リンパ色素サンプルを 1.5 mL キュベットに移し、Shimadzu UV-1800 UV/可視走査分光光度計を使用して吸光度スペクトルを取得しました。スペクトルデータは、Shimadzu UVProbe および R ソフトウェアを使用して分析されました。

成体を-20℃で1日間凍結させた。細いハサミを使用して蝶の羽を取り除き、ライカ DMS1000 顕微鏡で画像化しました。成人の眼のイメージングでは、死後の複眼の色の変化の程度を最小限に抑えるために、イメージング前に成人を-20°Cで40分間凍結させました。

蛹の羽組織を野生型個体から 15% PD (24 時間) で解剖し、Invitrogen™ RNAlater™ Stabilization Solution 中に保存しました。 Qiagen RNeasy Plus Micro Kit (カタログ番号 74034) を使用して、全 RNA を抽出および精製しました。 Invitrogen™ SuperScript™ II Reverse Transcriptase (カタログ番号 18064014) を使用して相補 DNA を合成し、50 ng/μL に希釈しました。 2×PCRBIO Taq Mix Red（カタログ番号：PB10.11-20）を使用して、目的の遺伝子および参照遺伝子ef1α（表S4）に特異的なプライマーを使用してcDNAに対してPCRを32サイクル実施しました。 PCR 産物は 1% アガロースゲル上で実行され、ゲルドキュメンテーションシステム (Azure 200 Gel Imaging System: AZI200) で画像化されました。

細い金属針を使用して、WT成体の羽から鱗を採取しました。次に、スケールを SEM スタブに固定されたカーボンテープに取り付け、JEOL JFC-1600 オートファインコーターを使用してプラチナコーティングを行い、JEOL JSM-6701F 電界放出型 SEM で画像化しました。

現在の研究で分析されたデータセットは、NCBI リポジトリで入手できます。使用されるすべての配列は、その遺伝子 ID および直接リンクとともに補足ファイルに記載されています。

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fv3000 共焦点顕微鏡の利用については CBIS、NUS、支援と紫外可視分光光度計の利用については Lee Ka Yau (NUS 化学科の SEM 施設) の Leong Weng Kee 准教授と Teresa Lim に感謝します。 SEM サンプルの画像化には彼の協力があり、ジュノニアアルマナとジュノニアコエニアの成虫の提供にはスリヤナラヤナンムルゲサンが協力してくれました。また、私たちの調査結果を解釈する上で貴重な洞察を与えてくださったロバート D. リード教授にも感謝いたします。

この研究は、国立研究財団 (NRF) シンガポールの調査プログラム (NRF-NRFI05-2019-0006 賞) および NRF 競争研究プログラム (NRF-CRP20-2017-0001 賞) の下で支援されました。

How Hon Chuen Shaun と Tirtha Das Banerjee の著者も同様に貢献しました。

シンガポール国立大学生物科学部、シンガポール、117557、シンガポール

ハウ・ホン・チュエン・ショーン、ティルタ・ダス・バナジー、アントニア・モンテイロ

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執筆 - 原案: HHCS、TDB。執筆 - レビューおよび編集: HHCS、TDB、AM。概念化: TDB、AM。方法論と調査: HHCS、TDB。検証: HHCS、TDB; 正式な分析: HHCS、TDB; リソース: AM; データキュレーション: HHCS、TDB; 視覚化: HHCS、TDB; 監修：TDB、AM プロジェクト管理: AM; 資金調達：AM

Tirtha Das Banerjee または AntÌnia Monteiro への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Shaun, HHC、Banerjee, TD & Monteiro, A. バーミリオンと辰砂は、目の単色色素生合成に関与していますが、Bicyclus anynana 蝶の羽には関与していません。 Sci Rep 13、9368 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-36491-9

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受信日: 2023 年 2 月 13 日

受理日: 2023 年 6 月 5 日

公開日: 2023 年 6 月 9 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36491-9

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